嗜甘草的植物乳桿菌及其制備的甘草益生菌制劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種嗜甘草的植物乳桿菌及其制備的甘草益 生菌制劑及制備方法。
【背景技術】
[0002] 甘草，學名Glycyrrhiza uralensis Fisch，別名國老、甜草、烏拉爾甘草、甜根子， 是豆科甘草屬多年生草本植物，根與根狀莖粗壯，是一種補益中草藥，在中國、印度和希臘 的古代醫藥典籍中多有記載，至今已有幾千年的使用歷史。在中藥中，甘草常用于治療心氣 虛，心悸怔忡，脾胃氣虛，倦怠乏力，咽喉腫痛，氣喘咳嗽，清熱解毒等。
[0003] 現代藥物化學分析表明，甘草的化學組成極為復雜，目前為止從甘草中分離出的 化合物有甘草甜素、甘草次酸、甘草甙、異甘草甙、新甘草甙、新異甘草甙、甘草素、異甘草素 以及甘草西定、甘草醇、異甘草醇、7-甲基香豆精、傘形花內酯等數十種化合物，目前，國內 外藥理界研宄表明，甘草及其提取物具有保肝、抗炎、抗病毒、抗菌、抗癌、抗氧化、鎮咳、免 疫調解、降糖和抗血小板凝集等多種活性，證實甘草在肝病治療、糖尿病治療、缺血再灌注 損傷、阿爾茨海默癥、帕金森氏癥、癲癇、抑郁、癌癥治療方面有更好的開發和應用前景，目 前臨床用于治療呼吸系統、消化系統、免疫系統等多種疾病。
[0004] 甘草是一類植物藥類益生元，可促進多種益生菌生長。早在1998年，日本學者新 納靖規就發現甘草經乳酸菌發酵后的發酵液提取物（GL)具有多種肝臟保護作用，并將其 開發成為一種護肝類保健食品。
[0005] 微生態制劑（Probioties)，也叫活菌制劑（Bigone)或生菌劑，是指運用微生態 學原理，利用對宿主有益無害的益生菌或益生菌的促生長物質，經特殊工藝制成的制劑。目 前，在食品領域，以乳酸菌發酵為代表的微生態制劑是近年來健康食品和保健食品開發中 的一支新生力量。鑒于甘草具有多種藥理活性作用，因此，開發一種甘草微生態制劑具有廣 闊的應用前景。
【發明內容】
[0006] 有鑒于此，本申請發明人在乳桿菌發酵甘草的研發過程中，獲得了一株以甘草為 唯一營養成分的嗜甘草的植物乳桿菌，且該菌在此培養環境中能夠旺盛繁殖。然后，利用該 植物乳桿菌的嗜甘草特性，用該菌株發酵甘草，制備出一種包含植物乳桿菌和甘草發酵物 的益生菌制劑，經初步研宄結果顯示，該益生菌制劑對化學性肝損傷（如酒精性肝炎和中 毒性肝炎）、慢性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎有預防及輔助治療的作用。
[0007] 因此，本發明的目的之一在于提供一種嗜甘草的植物乳桿菌，該嗜甘草的植物乳 桿菌在以甘草為唯一營養成分的培養基環境中能夠旺盛繁殖；本發明的目的之二在于提供 含有該嗜甘草的植物乳桿菌的制劑，所述制劑含有藥學上一切可接受的載體；本發明的目 的之三在于提供一種具有護肝功能的甘草益生菌制劑，該甘草益生菌制劑包括上述的嗜甘 草的植物乳桿菌和甘草發酵物，對化學性肝損傷（如酒精性肝炎和中毒性肝炎）、慢性肝 炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎有預防及輔助治療的作用；本發明的目的之四在于提供具有護 肝功能的甘草益生菌制劑的制備方法，所述制備方法操作簡單，易于工業化生產；本發明的 目的之五在于提供所述的具有護肝功能的甘草益生菌制劑在制備預防或治療肝臟疾病藥 物中的應用。
[0008] 為實現上述目的，本發明的技術方案為：
[0009] 嗜甘草的植物乳桿菌，生物保藏編號為CCTCC NO:M 2013449,所述嗜甘草的植物 乳桿菌在添加甘草和/或甘草浸液的培養環境中繁殖旺盛。本發明所得的嗜甘草的植物乳 桿菌在以甘草為唯一營養成分的培養基環境中能夠旺盛繁殖，其在制備保健食品尤其是微 生態制劑中具有廣泛的應用。
[0010] 生物保藏信息說明：
[0011] 嗜甘草的植物乳桿菌是在以甘草為唯一營養成分的培養基環境中能夠旺盛繁殖， 命名為Lactobacillus plantarum BL-WHSYM9,已于2013年9月26日保藏于中國典型培養 物保藏中心，保藏地址為中國武漢，其保藏編號為：CCTCC N0:M 2013449。
[0012] 嗜甘草的植物乳桿菌BL-WHSYM9生物學特征如下：屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬， 革蘭氏陽性，45°C不生長，兼性厭氧菌，在pH4. 5-9. 5生長，最適pH6. 5左右。菌種呈短桿狀， 有時呈鏈狀或者呈對狀，不產生芽孢；在LBS瓊脂培養基中呈灰白色、不透明、圓形、光滑、 微小細密的菌落；屬于通行發酵乳酸菌，能利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、L-山梨糖、乳糖等。
[0013] 本發明所述的甘草浸液為甘草的浸提液，通過任何常規操作方法浸提均可，在本 發明的一個具體實施例中，所述甘草浸液的制備，以10%甘草浸液配制為例：l〇〇g甘草超 微粉體，加水2L，浸泡40分鐘，煎煮40min，4層紗布過濾；藥渣再加水2L，煎煮40min，4層 紗布過濾；合并兩次濾液，經60-300目（如依次經過60、KKK200目）分級過濾，濃縮濾液 至1L。
[0014] 嗜甘草的植物乳桿菌是本申請的發明人在乳桿菌發酵甘草過程中獲得的，其具體 的制備方法包括如下進行的步驟：
[0015] (l)LBS培養基培養：取人新鮮糞便，在LBS培養基上劃線，37±2°C厭氧培養 20-48h ；
[0016] (2)MRS培養基培養：挑選步驟（l)LBS培養基上得到的不同形態的菌落分別接種 到MRS固體培養基上，37±2°C厭氧培養20-48h ;
[0017] (3)耐甘草乳桿菌篩選：挑選步驟（2)MRS固體培養基上得到的不同培養特征的乳 桿菌菌落分別接種到以甘草為唯一碳源的篩選培養基上，37±2°C厭氧培養20-48h，篩選 得到耐甘草乳桿菌；所述篩選培養基配方為：5%甘草浸液200mL/L，酵母膏0. 5g/L，硫酸銨 5g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0. 5g/L，瓊脂15g/L。
[0018] (4)馴化：將步驟（3)得到的耐甘草乳桿菌接種到含5%甘草浸液的液體培養基 中，37±2°C培養20-48h后轉接到含10%甘草浸液的液體培養基中，以此類推，最終轉接到 含50%甘草浸液的液體培養基中；所述液體培養基的配方為：梓檬酸按2g/L，乙酸鈉5g/L， 磷酸氫二鉀5g/L，硫酸猛0. 2g/L，硫酸鎂0. 5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/ L，吐溫-80 lmL/L，（5-50) %甘草浸液200mL/L ;經多次馴化，得到穩定生長活性的嗜甘草 的植物乳桿菌。
[0019] 所述的嗜甘草的植物乳桿菌的制備方法，所述的LBS培養基，在一個具體實施例 中，其配方為：酵母浸粉0. 5 %，胰酪蛋白胨1 %，磷酸二氫鉀0. 6 %，硫酸亞鐵0. 0034 %，硫 酸鎂0. 0575 %，葡萄糖2 %，乙酸鈉2. 5 %，檸檬酸銨0. 2 %，硫酸錳0. 012 %，瓊脂1. 5 %，吐 溫-80 lmL，冰乙酸1.3mL;調節pH值為5. 5±0. 2。當日使用，無需高壓滅菌，次日使用，需 118°C高壓滅菌15min。
[0020] 所述的嗜甘草的植物乳桿菌的制備方法，所述的MRS培養基，在一個具體實施例 中，其配方為：葡萄糖2. 0%，檸檬酸銨0. 2%，乙酸鈉0. 5%，磷酸氫二鉀0. 5%，硫酸錳 0. 02%，硫酸鎂0.05%，蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，酵母膏0.5%，吐溫-80 0. 1%，瓊脂 1. 5% ;調節 pH 6. 0±0. 2,121°C高壓滅菌 15min。
[0021] 含有本發明所述的嗜甘草的植物乳桿菌的制劑，所述制劑含有藥學上一切可接受 的載體。
[0022] 優選的，所述制劑包括凍干粉末、膠囊或片劑。
[0023] 優選的，所述制劑中嗜甘草的植物乳桿菌的活菌數多IX 108cfu/g。
[0024] 具有護肝功能的甘草益生菌制劑，所述甘草益生菌制劑包括本發明所研發的嗜甘 草的植物乳桿菌和甘草發酵物，所述甘草發酵物是由本發明所研發的嗜甘草的植物乳桿菌 發酵甘草和/或甘草浸液制備得到。經初步研宄結果顯示，該益生菌制劑對化學性肝損傷 (如酒精性肝炎和中毒性肝炎）、慢性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎有預防及輔助治療的 作用。
[0025] 本發明進一步提供了具有護肝功能的甘草益生菌制劑的制備方法，將生物保藏編 號為CCTCC NO:M 2013449的嗜甘草的植物乳桿菌接種于發酵培養基中發酵，所得發酵產物 即為具有護肝功能的甘草益生菌制劑，上述所得發酵產物應理解為發酵結束后所得的所有 產物，包括菌和經過發酵后的發酵培養基。所述發酵培養基中添加有甘草和/或甘草浸液， 所述發酵培養基中還包括其他利于乳酸菌發酵的氮源、無機鹽和生長因子等。在本發明的 一個具體實施例中，所述發酵培養基配方為：酪蛋白胨10. 〇〇g/L，檸檬酸三銨2. 00g/L，牛 肉膏10. 00g/L，乙酸鈉5. 00g/L，酵母浸膏5. 00g/L，硫酸鎂0? 50g/L，葡萄糖20. 00g/L，硫酸 錳0.2§/1，磷酸氫二鉀5.0(^/1，吐溫1.0(^/1，10%甘草浸液200111171 ;10%甘草浸液配制 方法：100g甘草超微粉體，加水2L，浸泡40分鐘，煎煮40min，4層紗布過濾，藥渣加水2L， 煎煮40min，4層紗布過濾，合并兩次濾液，經60、KKK200目分級過濾，濃縮濾液至1L。
[0026] 進一步，所述的制備方法，所得的發酵產物經過離心，取沉淀部分（沉淀部分包括 中層菌體和下層藥泥）添加凍干保護劑進行真空冷凍干燥，得干粉狀甘草益生菌制劑。所 述的離心、真空冷凍干燥采用本領域任何常規操作均可實現。所述的凍干保護劑為凍干領 域常用的保護劑，包括戊五醇、蔗糖、脯氨酸、脫脂奶粉等，優選脫脂奶粉。
[0027] 優選的，所述的制備方法，所述用于接種發酵的嗜甘草的植物乳桿菌菌齡為 12-24h，更優選的為24h。合適菌齡的菌種可通過菌種活化和/或擴大培養來實現，在本發 明的一個具體實施例中，所述菌種活化是將凍干的嗜甘草的植物乳桿菌菌粉接種于固體斜 面活化培養基上，在25-40°C培養22-26h。