一種蘇云金芽孢桿菌及選育方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種蘇云金芽孢桿菌及選育方法，及其在制備生物農藥領域中的應 用。
【背景技術】
[0002] 軟腐病俗稱"半邊瘋"，是魔芋生產上危害最嚴重的病害。魔芋軟腐病屬軟腐歐文 氏菌屬（Erwinia)，是一種革蘭氏陰性細菌，胡蘿卜軟腐歐氏桿菌胡蘿卜軟腐亞種（Erwinia carotovora subsp. carotovora)，栽培期及藏期可發病，影響產量和品質。魔芋種植業每 年因軟腐病損失巨大。
[0003] 幾個世紀以來，化學農藥在植物病蟲害的防治中發揮了巨大作用，為農業的增產、 穩產和提高品質做出了重要貢獻。但是由于過量施用和濫用農藥導致地力衰退和環境污 染。尤其近幾年來由于農藥殘留超標，嚴重影響了人們的生活質量。在當前農作物無公害栽 培中，微生物農藥越來越受到重視。因為它們不僅防治病蟲害的效果好，而且對環境友好、 對農作物無污染，病蟲對其不易產生抗藥性。因此，在生物農藥中，以微生物農藥用途多、應 用前景最為廣闊。
[0004] 芽孢桿菌屬的細菌為好氧或兼性厭氧的桿菌，廣泛分布在水、空氣和土壤中。芽孢 桿菌在孢子狀態下穩定性好，能耐氧化；耐擠壓；耐高溫，能長期耐60°C高溫，在120°C溫度 下能存活20分鐘；耐酸堿，在酸性胃環境中能保持活性，可以耐唾液和膽汁的攻擊，是飼料 微生物中可100%直達大小腸的活菌。同時本品具有安全高效，無藥殘，無毒副作用，能減少 抗生素藥物的使用，增強免疫力的優點，因而在生物防止病蟲害中起著重要作用。目前芽孢 桿菌屬用于防止病蟲害主要有：枯草芽孢桿菌、臘狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌等。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種蘇云金芽孢桿菌（Bacillussubtilis)MLl，該蘇云金 芽孢桿菌對魔芋軟腐病原有很好的抑制作用，為開發新的生物農藥品種、植物生物防治菌 劑提供了新選擇。
[0006] 所述蘇云金芽孢桿菌（Bacillussubtilis)MLl是從疏花水柏枝 (MyricariaLaxiflora)的葉中獲得的內生細菌，于2014年5月5日保藏于中國典型培養物 保藏中心，保藏編號為，CCTCC N0:M2014181。保藏地址為中國，武漢，武漢大學。
[0007] 本發明蘇云金芽孢桿菌（Bacillussubtilis)MLl在牛肉膏蛋白胨培養基上具有 以下微生物學特性：米白色，表面較干燥，單菌落較小且呈圓形，革蘭氏陽性，具有芽孢。
[0008] 本發明還提供蘇云金芽孢桿菌的選育方法，包括如下步驟：
[0009] 1)取疏花水柏枝葉，加入無菌水中，研磨搗碎得組織液，吸取組織液加入無菌水 中，再用無菌水稀釋組織液濃度至10'10'10'10'10'10'1(T 7共7個濃度梯度；
[0010] 2)取上述各濃度梯度稀釋液100UL分別涂布于培養基平板中，倒置恒溫箱內 30°C培養；
[0011] 3)待上述平板上長出菌落后，挑取單菌落于滅菌的培養基中，恒溫30°C振蕩培養 24小時，得到細菌培養液；
[0012] 4)在滅菌的菌種管中，加入l.OmL細菌培養液，0.5ml 50 %的甘油，混勻后 于-86°C冰箱保存；5)取-86°C冰箱保存的蘇云金芽孢桿菌菌株菌種劃線接種于斜面培養 基中，30°C下，培養12小時；
[0013] 6)將上述菌體劃線接種于培養基中，30°C下，培養18小時，獲得蘇云金芽孢桿菌 體。
[0014] 所述的培養基是將牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、無菌水以質量比為2 :2 :1 :4 :11 混合后，在121°C滅菌20min后制得。
[0015] 將上述蘇云金芽孢桿菌，或以蘇云金芽孢桿菌為活性成分制得的菌劑應用于制備 生物防治植物病害的菌劑。
[0016] 或，將上述蘇云金芽孢桿菌菌株，或以蘇云金芽孢桿菌菌株為活性成分所制得的 菌劑應用于制備生物防治植物病害的菌劑。
[0017] 或，將上述云金芽孢桿菌菌株的微生物菌劑，或以蘇云金芽孢桿菌菌株的微生物 菌劑為活性成分制得的菌劑應用于制備生物防治植物病害的菌劑。
[0018] 另，將上述蘇云金芽孢桿菌或以蘇云金芽孢桿菌為活性成分應用于制備生物農藥 或以蘇云金芽孢桿菌為組分或活性成分應用于制備生物農藥組合物。
[0019] 或，將上述蘇云金芽孢桿菌菌株的發酵液或懸乳液，或以蘇云金芽孢桿菌菌株的 發酵液或菌懸液為活性成分應用于制備生物農藥；或以蘇云金芽孢桿菌菌株的發酵液或菌 懸液為組分或活性成分應用于制備生物農藥組合物。
[0020] 本發明還包括將蘇云金芽孢桿菌應用于防治魔芋軟腐病上。該蘇云金芽孢桿菌還 可以替換為蘇云金芽孢桿菌菌株、蘇云金芽孢桿菌菌株的發酵液、蘇云金芽孢桿菌菌株的 菌懸液、菌株的微生物菌劑中的任意一種。
[0021] 本發明的蘇云金芽孢桿菌（Bacillussubtilis)MLl具有較高的遺傳穩定性；對魔 芋軟腐病病原菌具有很好的拮抗作用且重現率很高。
[0022] 軟腐病俗稱"半邊瘋"，是魔芋生產上危害最嚴重的病害，魔芋種植業每年因軟腐 病損失巨大。由于化學農藥的過量施用導致地力衰退和環境污染，當前微生物農藥越來 越受到重視，應用前景最為廣闊。本發明提供了一種蘇云金芽孢桿菌（Bacillussubtilis) ML1，該蘇云金芽孢桿菌對魔芋軟腐病原有很好的抑制作用，為開發新的生物農藥品種、植 物生物防治菌劑提供了新選擇。
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發明的蘇云金芽孢桿菌（Bacillussubtilis)ML1的菌落形態，a為正面， b為反面。
[0024] 圖2為本發明的蘇云金芽孢桿菌（Bacillussubtilis)ML1的顯微形態。
[0025] 圖3為不同菌體對魔芋軟腐病病原菌拮抗作用效果，a為ML1菌體，b為鏈霉菌，c 為空白。
[0026] 圖4為本發明的蘇云金芽孢桿菌（Bacillussubtilis)MLl菌株的 16SrDNA 系統發育樹。B. toyonensis :toyonensis 芽抱桿菌；B. anthracis :炭 疽芽胞桿菌；B. thuringiensis :蘇云金芽孢桿菌；B. cereus :賭樣芽胞桿菌； colorkeyforalignmentscores :序列比對匹配度