在線工業(yè)魯棒化調(diào)控細(xì)胞狀態(tài)生產(chǎn)抗egfr單抗的裝置與方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物工程領(lǐng)域中可在線調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞狀態(tài)生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組抗EGFR單克隆抗體的過程,尤其涉及一種可在線工業(yè)魯棒化(industrially robust)連續(xù)監(jiān)控連續(xù)灌注生物反應(yīng)器及培養(yǎng)瓶/袋系統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中各項理、生、化指標(biāo)，并可直接在線調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞培養(yǎng)、擴(kuò)增和制備重組抗EGFR單克隆抗體的裝置和方法，以維持重組抗EGFR單克隆抗體的高質(zhì)、高效生產(chǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002]表皮生長因子受體(EGFR)是一個170kDa的跨膜糖蛋白受體酪氨酸激酶，由表皮生長因子激活，影響細(xì)胞的生長和分化。EGF或TGFa對EGFR的結(jié)合激活受體的酪氨酸激酶活力。EGFR羧基末端的酪氨酸殘基Tyrl068、Tyrl 148、和Tyrl 173是EGF結(jié)合后發(fā)生的自動磷酸化的主要位點(diǎn)。一旦被激活，EGFR1068位和1173位磷酸化的酪氨酸殘基就能介導(dǎo)Grb2對EGFR的結(jié)合。此外，1173位磷酸化的酪氨酸殘基是SHC在EGFR上的主要結(jié)合位點(diǎn)。EGFR廣泛分布在許多正常和惡性上皮細(xì)胞中，其過度表達(dá)和自我激活可能與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。目前主要用于各種上皮源性惡性腫瘤包括頭頸部鱗癌、肺癌、乳腺癌和膀胱癌等的研究。
[0003]表皮生長因子與其受體一表皮生長因子受體結(jié)合后可引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)變化，最終使細(xì)胞發(fā)生分化或增殖。表皮生長因子受體是一種受體酪氨酸蛋白激酶，而受體酪氨酸蛋白激酶一Ras — MAPK級聯(lián)途徑是表皮生長因子刺激信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)的最主要途徑。它由以下成員組成:表皮生長因子受體一含有SH2結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白(如Grb2)—鳥嘌呤核苷酸釋放因子(如S0S) — Ras蛋白一MAPKKK(如Rafl) — MAPKK — MAPK —轉(zhuǎn)錄因子等。
[0004]表皮生長因子與受體結(jié)合后，可以使受體發(fā)生二聚體化，從而改變了受體的構(gòu)象，使其中的蛋白酪氨酸激酶活性增強(qiáng)，受體自身的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，磷酸化的受體便形成了與含SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白分子Grb2結(jié)合的位點(diǎn)，導(dǎo)致Grb2與受體的結(jié)合。Grb2中有兩個SH3結(jié)構(gòu)域，該部位與一種稱為SOS的鳥苷酸交換因子結(jié)合，使之活性改變，SOS則進(jìn)一步活化Ras，激活的Ras作用于MAPK激活系統(tǒng)，導(dǎo)致ERK的激活。最后ERK轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，導(dǎo)致某些轉(zhuǎn)錄因子的活性改變從而改變基因的表達(dá)狀態(tài)及細(xì)胞的增殖與分化過程。
[0005]EGFR是原癌基因c-erbBl的表達(dá)產(chǎn)物，是表皮生長因子受體(HER)家族成員之一。該家族包括 HERl (erbBl，EGFR)、HER2 (erbB2，NEU)、HER3 (erbB3)及 HER4 (erbB4)。
[0006]EGFR廣泛分布于哺乳動物上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面，EGFR信號通路對細(xì)胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相關(guān)信號通路中關(guān)鍵因子的活性或細(xì)胞定位異常，均會引起腫瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的發(fā)生。
[0007]結(jié)直腸癌H治療藥Vectibix (抗EGFR單克隆抗體、帕尼單抗)是第一個完全人源化單克隆抗體，其靶向作用于表皮生長因子受體(EGFR)。
[0008]根據(jù)檢索，美國專利US20090384826 ((Method of determining the sensitivityof cancer cells to EGFR inhibitors including cetuximab,抗 EGFR 單克隆抗體 anderlotinib))中，提出了測定癌細(xì)胞對EGFR抑制劑包括cetuximab,抗EGFR單克隆抗體和erlotinib敏感性的方法,但是對于生產(chǎn)抗EGFR單克隆抗體的工藝卻沒有涉及。
[0009]就重組抗EGFR單克隆抗體的產(chǎn)業(yè)化工藝而言，現(xiàn)代動物細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)表達(dá)技術(shù)是上述產(chǎn)品的關(guān)鍵核心技術(shù)，該技術(shù)工藝復(fù)雜、難度大。這些先進(jìn)的重組蛋白生產(chǎn)技術(shù)掌握在國外少數(shù)制藥公司手中，幫助這些跨國公司攫取高額利潤。而我國比世界先進(jìn)技術(shù)水平相差懸殊，是牽扯到一系列技術(shù)的整體性工業(yè)的差距。因此，我們不僅需要快速追趕，縮小差距，更需要加快技術(shù)研發(fā)，在相關(guān)領(lǐng)域取得跨越式發(fā)展，形成真正具有自主知識產(chǎn)權(quán)的重組抗EGFR單克隆抗體生產(chǎn)的核心關(guān)鍵技術(shù)。
[0010]目前，重組抗EGFR單克隆抗體的生產(chǎn)表達(dá)方法通常為采用批培養(yǎng)，分批補(bǔ)料培養(yǎng)等。這些重組蛋白生產(chǎn)工藝雖然已經(jīng)被放大至1000L以上，但是工藝本身存在如下缺點(diǎn):I)培養(yǎng)，表達(dá)過程的參數(shù)控制較少，不能完全或只能部分程度的控制培養(yǎng)環(huán)境的理化條件如溫度，pH, CO2和O2濃度，營養(yǎng)物質(zhì)濃度等；2)即使通過反應(yīng)器對理、生、化條件進(jìn)行精確控制，但這種控制方法仍然缺乏對細(xì)胞狀態(tài)本身的精確調(diào)節(jié)和控制。處于生長和蛋白過程中的細(xì)胞狀態(tài)可以極大地影響最終表達(dá)的重組蛋白質(zhì)量(如蛋白質(zhì)的糖基化水平，蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)的正確形成)，而細(xì)胞狀態(tài)并不僅僅是通過上述理、生、化等參數(shù)對細(xì)胞的影響所能決定的，對于抗EGFR單克隆抗體這樣的蛋白來說，生產(chǎn)獲得的蛋白活性更加是遠(yuǎn)遠(yuǎn)比單純的蛋白質(zhì)量重要；3)批次培養(yǎng)獲得的細(xì)胞的重復(fù)性較低，且極大地受到不同實驗和生產(chǎn)技術(shù)人員個人操作的影響，在試驗和生產(chǎn)中會出現(xiàn)較大的批次間差異(batch to batchvariat1n)，這也是目前藥物品質(zhì)控制和監(jiān)管領(lǐng)域的難題之一。因此，一種具有簡便可靠性的(robust)可大規(guī)?；?scalable)應(yīng)用于工業(yè)化(industrial)抗EGFR單克隆抗體是目前表達(dá)工藝(process development)研究領(lǐng)域的瓶頸。
[0011 ] 此外，對于傳統(tǒng)工藝用細(xì)胞狀態(tài)“好”與“壞”來描述細(xì)胞是一種口語化的表達(dá)，而“延遲期”，“對數(shù)生長期”和“平臺期”等言語也是一個較為籠統(tǒng)的概念，不夠精確和準(zhǔn)確。據(jù)公開報導(dǎo)和本公司研究部門的研究結(jié)果，細(xì)胞生長的狀態(tài)與整個群體的細(xì)胞周期分布具有一定的相關(guān)性。按照細(xì)胞在分裂過程中表現(xiàn)出的顯著性差異的行為，細(xì)胞周期可以大致分為三個階段(圖1 (圖片來源于:Hwww.newearthb1med.0rgH)):gaplphase (Glphase,Gl期)是一個細(xì)胞周期的起始階段，在這個階段，細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行相關(guān)蛋白質(zhì)的合成等行為，細(xì)胞體積和基因組不產(chǎn)生任何變化，隨后，細(xì)胞會根據(jù)自身所處的環(huán)境來判斷是否跨越過限制點(diǎn)(restrict1n point),進(jìn)入 DNA 合成期(DNA synthesis phase, S phase, S 期)，在S期，細(xì)胞主要進(jìn)行自身基因組DNA的合成復(fù)制，復(fù)制完畢后，細(xì)胞成為2倍體，即基因組翻倍，隨后細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期(gap2/mitotic phase, G2/M phase, G2/M期),在此時期,細(xì)胞完成有絲分裂，得到兩個相同的子細(xì)胞，完成了一個細(xì)胞周期。當(dāng)細(xì)胞所處環(huán)境不佳不利于細(xì)胞生長時，細(xì)胞無法跨過限制點(diǎn)，從而跳出細(xì)胞周期，進(jìn)入一個額外的沉默期(restingphase, GOphase),成為不分裂細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞在不同周期的細(xì)胞行為，通過細(xì)胞核染色試劑檢測細(xì)胞核的DNA含量，配合流式細(xì)胞儀即可分辨單個細(xì)胞所處的細(xì)胞周期并繪制整個群體的細(xì)胞周期分布圖。對于正常培養(yǎng)過程中的細(xì)胞而言，細(xì)胞整體是一個異步培養(yǎng)體系(asynchronous culture),即在培養(yǎng)過程中細(xì)胞整體并不處于細(xì)胞周期的相同位置,而是隨機(jī)分布在細(xì)胞周期的各個位置。由于處于細(xì)胞周期不同時期的細(xì)胞在蛋白過程中表現(xiàn)出的特性可能并不相同，因此細(xì)胞整體所呈現(xiàn)的結(jié)果可能實質(zhì)上是由處于不同細(xì)胞周期，不同狀態(tài)的細(xì)胞的所占比例的動態(tài)變化一即細(xì)胞周期分布導(dǎo)致的。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0012]由于細(xì)胞生長狀態(tài)本身極大地影響最終表達(dá)的重組蛋白質(zhì)量，而傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白表達(dá)方法如批培養(yǎng)和補(bǔ)料培養(yǎng)工藝中對于細(xì)胞狀態(tài)的控制相對缺乏，同時細(xì)胞狀態(tài)并不僅僅是通過上述理化參數(shù)對細(xì)胞的影響所能決定的。因此，實現(xiàn)對細(xì)胞生長狀態(tài)(即細(xì)胞生長，細(xì)胞周期分布等具體參數(shù))的精確控制，是建立具有簡便可靠性的魯棒化(robust)可大規(guī)模化(scalable)應(yīng)用于工業(yè)化(industrial)抗EGFR單克隆抗體表達(dá)工藝(processdevelopment)的重要工作。
[0013]本發(fā)明的目的在于，針對目前單克隆抗體傳統(tǒng)制備工藝中的上述缺點(diǎn)，提供一種既可在線、連續(xù)、監(jiān)控多種細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中理生化指標(biāo)，又可以直接調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞狀態(tài)(包括細(xì)胞周期等)的生物反應(yīng)器類細(xì)胞培養(yǎng)裝置及由該裝置生產(chǎn)抗EGFR單克隆抗體的方法，使其降低染菌風(fēng)險，維持細(xì)胞生長環(huán)境穩(wěn)定，保持細(xì)胞恒定生長活力，達(dá)到高質(zhì)、高效連續(xù)生產(chǎn)抗EGFR單克隆抗體的目的。
[0014]對于傳統(tǒng)工藝用細(xì)胞狀態(tài)“好”與“壞”來描述細(xì)胞是一種口語化的表達(dá)，而“延遲期”，“對數(shù)生長期”和“平臺期”等言語也是一個較為籠統(tǒng)的概念，不夠精確和準(zhǔn)確。本發(fā)明使用細(xì)胞比生長速率(μ )作為精確描述細(xì)胞生長的動力學(xué)參數(shù)，可以在一定程度上反映細(xì)胞狀態(tài)。據(jù)發(fā)明人的研究結(jié)果，這一生長動力學(xué)參數(shù)與細(xì)胞周期分布、細(xì)胞在細(xì)胞周期內(nèi)停留時間呈密切關(guān)系，通過特定裝置組成聯(lián)動系統(tǒng)調(diào)節(jié)，可以實現(xiàn)精確調(diào)控細(xì)胞狀態(tài)的目標(biāo)。