一種核殼結構的溫敏性磁性蛋白質印跡微球的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種核殼結構的溫敏性磁性蛋白質印跡微球的制備方法及其在蛋白分離純化中的應用，屬于高分子化學和蛋白質工程技術領域。
【背景技術】
[0002]分子印跡技術是以某一特定目標分子為模板，制備針對該分子具有特異性選擇作用的高分子化合物一分子印跡聚合物(MIPs)的技術。分子印跡聚合物上的特定識別位點和空間結構與模板分子相匹配，可特異性的吸附模板分子，因此分子印跡技術被稱為“人工鎖技術”。分子印跡技術已廣泛應用于生物傳感，催化，分離，藥物釋放以及固相萃取等領域中。盡管目前小分子印跡技術發展蓬勃，但是蛋白質等生物大分子印跡技術仍面臨眾多挑戰。
[0003]蛋白質構象復雜，且具有一定的生物活性，溶于水，在非溫和條件下，容易失活，導致空間結構變化。分子量大，難洗脫。因此在蛋白質分子印跡聚合物的制備過程中，克服上述困難尤為重要和迫切。
[0004]表面印跡技術即在載體上制備分子印跡膜的技術，有利于模板分子的洗脫和重新識別。目前應用較普遍的載體有硅球、納米管、納米線。由于蛋白質的水溶性使得分子印跡聚合反應需在水相中進行。因此載體必須在水相中有較好的分散性。蛋白質印跡相關研宄中硅球使用較為廣泛，但是制備的分子印跡膜對目標蛋白吸附量和特異性較低。因此在載體表面合成更多的識別位點和輔助識別聚合物鏈可有效提高對目標蛋白的選擇性吸附；并且使載體上帶有的與模板蛋白相反電荷，可促進預組裝過程中，載體與模板的結合。
[0005]磁性MIPs能在外界磁場的作用下，能從復雜體系中迅速分離，因此國內外對其應用研宄較為活躍。但磁性Fe3O4納米顆粒容易團聚，且容易氧化。傳統的制備方法和儲存方法應進一步改進。
[0006]溫敏性聚合物是一種能根據溫度變化而改變收縮或溶脹的智能材料，其中溫敏單體N-異丙基丙烯酰胺應用較為廣泛。其臨界溫度為32°C?34°C，高于該溫度，聚合物呈收縮狀態，低于該溫度，呈膨脹狀態。可通過調節外界溫度調節聚合物體積，進而實現對目標分子的捕捉或釋放。國內外研宄工作中，國內外熱衷于對蛋白分子印跡中溫敏材料的開發，但具體合成溫度范圍和洗脫溫度范圍并未明確探宄。
[0007]目前為止，識別孔腔底部含吸引模板分子位點，且表面含一定的排斥模板分子位點的溫敏性磁性蛋白質印跡微球國內外鮮有報道。
【發明內容】
[0008]針對現有的分子印跡技術分離蛋白的方法存在的缺陷，本發明的目的是在于提供一種通過簡單工藝制備表面具有溫敏性分子印跡膜，可通過控制溫度變化來選擇性從生物體系中分離目標蛋白的，且可通過磁性分離的具有核殼結構的溫敏性磁性蛋白質印跡微球的方法。
[0009]本發明的另一個目的是在于提供所述印跡微球在分離蛋白技術上的應用，印跡微球在較高溫度下可選擇性吸附目標蛋白，在較低溫下釋放，特異性好，可以采用磁場分離，使用方便高效，為復雜生物體系中目標蛋白質的富集分離提供了新的可行性技術方法。
[0010]為了解決現有技術中的缺陷，本發明提供了一種核殼結構的溫敏性磁性蛋白質印跡微球的制備方法，包括以下步驟:
[0011 ] 步驟一:通過有機溶劑-水熱法制備Fe3O4納米顆粒；
[0012]步驟二:以4-乙烯基吡啶為聚合單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯劑，通過沉淀聚合法，在Fe3O4納米顆粒表面修飾一層4-乙烯基吡啶聚合物膜，得到含有識別位點和輔助識別聚合物鏈的磁性微球載體；
[0013]步驟三:將含有識別位點和輔助識別聚合物鏈的磁性微球載體、N-異丙基丙烯酰胺，甲基丙烯酸，模板分子蛋白，交聯劑加入到中性PBS緩沖液中進行預組裝后，通過引發劑引發聚合，在35°C?39°C溫度下進行聚合反應；
[0014]步驟四:將步驟三的聚合產物，在20°C?30°C溫度下，通過振蕩洗脫模板分子蛋白，即得具有核殼結構的溫敏性磁性蛋白質印跡微球。
[0015]本發明的核殼結構的溫敏性磁性蛋白質印跡微球的制備方法還包括以下優選方案:
[0016]優選的方案，先將FeCl3.6H20溶于乙二醇中得到前驅體溶液，在前驅體溶液中加入醋酸鈉和分散劑后，置于反應釜中，在195?205°C溫度下進行有機溶劑-水熱反應，得到Fe3O4納米顆粒。優選的方案能得到顆粒均勻，且分散性好的的Fe3O4納米顆粒。優選的分散劑為聚乙二醇600。
[0017]優選的方案，步驟二中將4-乙烯基吡啶、Fe3O4納米顆粒和二甲基丙烯酸乙二醇酯分散在溶劑中，通過引發劑引發聚合后，在55?65°C溫度下進行聚合反應，聚合反應完成后，通過磁場分離，得到含有識別位點和輔助識別聚合物鏈的磁性微球載體；其中，4-乙烯基吡啶、Fe3O4納米顆粒和二甲基丙烯酸乙二醇酯的質量比為45?55:150?250:400。優選的方案更有利于在Fe3O4納米顆粒表面原位聚合生成一層均勻聚合物膜，使識別位點和輔助識別聚合物鏈在載體表面隨機相對均勻地分布。
[0018]優選的方案，含有識別位點和輔助識別聚合物鏈的磁性微球載體、模板分子蛋白、N-異丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸和交聯劑的質量比為38?42:5?7:10?12:1?3:1。優選的質量比例能使功能單體和聚合單體及交聯劑之間形成更完整的交聯網絡狀聚合物膜，將模板分子蛋白固定在含有識別和輔助識別位點聚合物鏈的磁性微球載體表面。
[0019]優選的方案，交聯劑為N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺。
[0020]優選的方案，所述的PBS緩沖液濃度為0.lmol/L，pH為7.0。
[0021]優選的方案，含有識別和輔助識別位點聚合物鏈的磁性微球載體與PBS緩沖液的用量比為 150mg ?300mg/10mL。
[0022]優選的方案，所述的預組裝是在溫度為35°C?39°C的條件下進預組裝5?8h。
[0023]優選的方案，步驟二中的沉淀聚合進行的時間為20?28h。
[0024]優選的方案，步驟二中的引發劑為偶氮二異丁腈。
[0025]優選的方案，步驟三中的聚合反應進行的時間為20?28h。
[0026]優選的方案，步驟三中聚合反應采用的引發劑是N，N，N’，N’ -四甲基二乙胺/過硫酸銨。
[0027]優選的方案，所述的洗脫是在溫度為20°C?30°C的條件下，依次通過去離子水、質量百分比濃度為36%的NaCl溶液，、質量體積比為1:10g/L的SDS溶液、體積百分比濃度為10 %的醋酸溶液振蕩洗脫，將模板分子蛋白洗脫出來。
[0028]優選的方案，模板分子蛋白為牛血清白蛋白。最優選的洗脫溫度為25°C。
[0029]本發明還提供了所述的制備方法制得的核殼結構的溫敏性磁性蛋白質印跡微球分子印跡微球的應用，應用于從含有目標蛋白的復雜生物體系中選擇性富集分離出目標蛋白。
[0030]優選的應用方法，核殼結構的溫敏性磁性蛋白質印跡微球分子印跡微球在35°C?39°C溫度下吸附目標蛋白，在20°C?30°C溫度下脫附目標蛋白。優選的方案中采用目標蛋白作為模板分子蛋白制備出具有核殼結構的溫敏性磁性蛋白質印跡微球，制得的具有核殼結構的溫敏性磁性蛋白質印跡微球對目標蛋白分子具有選擇性吸附能力。
[0031]相對現有技術，本發明的有益技術效果:1、通過改進的水熱法制備具有超順磁性的Fe3O4納米顆粒，制備的顆粒粒徑均勻，分散性好、不易團聚；Fe 304納米顆粒的引入使具有核殼結構的溫敏性磁性蛋白質印跡微球具有磁性，可以通過磁場分離，分離快速徹底。2、利用共沉淀方法在Fe3O4顆粒表面合成一層具有識別和輔助識別位點聚合物鏈薄膜，保護了 Fe3O4不易被氧化，同時親水性的吡啶基團有利于載體在水溶液中的分散；在預組裝過程中，載體上的吡啶基作為吸電子基團，有效的吸引牛血清白蛋白(中性溶液中帶負電荷)，載體上的聚合物鏈及輔助識別位點促進了目標蛋白與載體的預組裝，N-異丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸與載體，模板分子蛋白之間的預組裝有利于下一步聚合反應。3、溫敏性單體的加入，制得的印跡分子可以通過控制外界溫度控制聚合物的溶脹收縮狀態，從而控制吸附和解吸附過程；輔助單體甲基丙烯酸的加入，提供負電荷，減少了聚合物微球表面的非特異性吸附；與之前的分子印跡聚合物相比，該聚合物微球吸附量大，特異性高，選擇性好。特別是采用牛血清白蛋白制備作為模板分子蛋白制備的核殼結構的溫敏性磁性蛋白質印跡微球在胎牛血清中能快速分離富集牛血清白蛋白。
【附圖說明】
[0032]【圖1】為本發明制備核殼結構溫敏性磁性蛋白質印跡微球的流程示意圖；
[0033]【圖2】為Fe3O4(A)、載體⑶、和印跡微球(C)的掃描電鏡圖，Fe3O4O))和印跡微球(E)的透射電鏡圖；
[0034]【圖3】為印跡微球(MMPs)與非印跡微球(NMPs)的恒溫吸附圖；前者的吸附量明顯高于后者，且吸附速度較快；
[0035]【圖4】為印跡微球(MMPs)與非印跡微球(NMPs)的動態吸附圖:該印跡微球在前20min內吸附速度迅速增快并達到最大值隨后速度降低，50min達到吸附平衡；非印跡聚合微球吸附速率較前者慢，最大吸附量較低；
[0036]【圖5】為印跡微球(MMPs)與非印跡微球(NMPs)在不同的蛋白溶液中的吸附效果:依次為牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，牛血紅蛋白(BHb)，溶菌酶(Lyz)。可見印跡微球在牛血清白蛋白(BSA)的吸附量最高，印跡效率最高；
[0037]【圖6】為與印跡微球(MMPs)與非印跡微球(NMPs)在胎牛血清溶液中的應用:條帶1，3為稀釋的胎牛血清，2、4分別為經印跡微球(MMPs)與非印跡微球(NMPs)吸附過的胎牛血清溶液；可見條帶2中66.2KDa處變淺，而條帶4無明顯變化，直觀的表現出MMPs對牛血清白蛋白的吸附作用。
【具體實施方式】
[0038]以下實施例旨在進一步說明本
【發明內容】
，而不是限制本發明權利要求的保護范圍。
[0039]實施例1
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