用于基因組測序核酸擴增的聚苯乙烯微球的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因組測序領域，具體涉及一種應用于基因組測序核酸擴增的聚苯乙 烯微球的制備方法。
【背景技術】
[0002] 作為上世紀生命科學領域最重要的發明之一，DNA測序技術深刻地改變了人們對 生命本質的理解和掌控能力，極大地推動了全球生命科學領域研宄的發展。假如沒有測序 技術，基因序列就無法確定，酶切、克隆、反轉錄、cDNA、PCR、SNP、RNAi等研宄技術也就根本 無從談起，生命科學領域不會有今日的蓬勃發展。生命科學領域無人不曉的GenBank，以及 歷時13年耗資3億美元的全球合作完成的人類基因組計劃，無不建立在測序的基礎上。
[0003] 自1977年Sanger發明了利用了 DNA聚合酶的雙脫氧終止原理測定核苷酸序列 的技術以來，測序技術不斷改進，新方法相繼問世，測序規模也不斷擴大。測序技術的操作 簡單化、成本低廉化、以及高通量化成為測序技術的發展方向。SOLiD，454以及Solexa等 為代表的新一代高通量測序技術，以三國鼎立的姿態平分著序列測定的天下。三種技術各 有千秋，發展更新的速度可謂日新月異。但目前而言，其測序文庫制備的過程均仍較為復 雜。
[0004] 測序文庫的制備作為整個測序過程中的第一個且及其重要的一個步驟，對測序結 果的優劣有著決定性的作用。測序文庫的制備大體來說包括以下幾個步驟。第一步是如何 將核酸從待檢測的樣本中高質量地提取出來。針對不同的樣本，人們所選用的實驗流程和 方式將會有較大的差異；第二步是如何將長片段的核酸進行小片段花處理，主要針對基因 組DNA及長片段的RNA等樣本，因為目前測序儀對于讀長的限制，只能對制備的隨機小片段 進行測序，再通過生物信息學方法進行拼接，得出全基因組的序列信息。目前核酸小片段化 基本使用物理作用來進行，超聲波由于其自身的各種優點而成為打碎DNA的普遍方式，可 通過調節超聲功率及超聲時間來獲得不同長度的小片段DNA。第三步便是如何將小片段核 酸的兩端連接上測序所需的通用接頭序列；第四步是如何將連接有接頭序列的核酸序列進 行單分子多拷貝擴增，包括有乳液PCR、橋式PCR及滾環擴增等，在擴大測序信號強度的同 時確保真實的反映樣本的原始信息。而乳液PCR -般采用微球捕獲一個模板DNA到一個小 球，利用乳液PCR擴增單一模板，將同一模板在一個微球上擴增成上百萬個模板克隆。
[0005] -般來講，在乳液PCR中采用的微球為聚苯乙烯（PS)微球，并且在微球表面進行 鏈霉親和素修飾，從而使其可以捕獲生物素標記的DNA分子。目前，合成單分散PS微球 的方法有微乳液聚合法、乳液聚合法、分散聚合法、懸浮聚合法和種子聚合法等。但現有的 合成方法都是交聯劑和單體混合后再進行聚合，這種辦法合成的聚合物微球聚合物是整 體交聯的，往往球形度差，粒徑可控性低，因而通常需要分選才能達到粒徑分布偏差小于 5%的要求。為了合成得到交聯的微球，卻又不影響到微球的球形度和單分散性，日本專利 JP58-106554和JP63-191818雖然提出了種子聚合的方法，即先通過乳液聚合獲得種子，然 后進行增長，擴大粒子。本方法的缺點是微球在生長過程中，產生次級粒子，需要篩分除去， 造成產品收率降低，操作復雜，經濟性差。因此，要得到粒徑均一的微米級單分散具有交聯 的聚合物微球粒子是非常困難的。
[0006] 合成具有單分散性的聚合物微球難度很大，其反應條件苛刻，制備工藝復雜，反應 控制要求異常嚴格。聚合物微球的傳統合成方法有乳液聚合法和懸浮聚合法，乳液聚合法 只能制備小于500nm的微球，懸浮聚合法制備的微球雖然粒徑在100-1000 ym，但卻是多分 散性的，即使經過多次篩分也難以獲得單分散的微球，二十世紀七十年代發展起來的分散 聚合和種子聚合可以制備粒徑1-100 u m，且具有單分散性的聚合物微球，是目前制備單分 散性聚合物微球的較好方法，但分散聚合的反應介質需用有機溶劑如乙醇等，還需要加入 穩定劑如聚乙烯吡咯烷酮等，所用試劑對聚合產物的純度及后處理帶來麻煩。
【發明內容】
[0007] 本發明的一個目的是提供一種聚苯乙烯微球的制備方法，其制備的微球可用于基 因組測序文庫制備中的核酸擴增，所述微球粒徑為25微米，具體步驟如下： (1) 將分散劑加入反應介質中，通入氮氣；攪拌至均相體系； (2) 將苯乙烯單體和引發劑加入反應體系中；將反應體系升溫；然后在攪拌條件下進 行恒溫反應；冷卻至室溫、洗滌、干燥。
[0008] 在本發明的一個實施方案中，所述反應介質選自水、乙醇、乙二醇單甲醚和甲醇的 一種或者兩種以上的任意組合。在優選的實施方案中，所述反應介質為水和乙二醇單甲醚， 其中，水和乙二醇單甲醚的重量百分比為10~90%和10~90% ;也可以為20~40%和60~ 80%，優選為23%和77%。
[0009] 所述的分散劑為磷酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚丙烯酸、聚乙烯醇和羥丙 基纖維素中的一種或者兩種以上的任意組合。在優選的實施方案中，所述分散劑由聚乙 烯醇、羥丙基纖維素和聚乙二醇組成，聚乙烯醇、羥丙基纖維素和聚乙二醇的重量百分比為 10~80%、10~80%和10~80% ;也可以為20~40%、30~50%和20~50%，優選為25%、 35% 和 40%。
[0010] 引發劑選自偶氮二異丁腈（AIBN)或者過氧化苯甲酰（BPO)的一種或兩種的任意 比例組合。在優選的實施方案中，所述引發劑為偶氮二異丁腈。
[0011] 在本發明另一個實施方案中，在最終的反應體系中，苯乙烯單體、分散劑、引發劑 和反應介質的重量百分比依次為5~40%的苯乙烯單體，0. 1~1%的分散劑，0. 025~ 0. 125%的引發劑，反應介質余量；優選為32%的苯乙烯單體，0. 3%的分散劑，0. 05%的引發 劑，反應介質余量。
[0012] 本發明進一步地實施方案中，所述步驟（2)的將反應體系升溫至10-90°c，優選為 75°C ;攪拌速度控制在80~120轉/分鐘，優選為100轉/分鐘。
[0013] 分散聚合法制備單分散聚苯乙烯微球受單體、引發劑、分散劑和反應介質等4個 條件影響，而其中單體和分散劑是影響粒徑分布的兩個主要因素。在一定反應條件下，隨著 單體用量和濃度的增加，聚苯乙烯微球的粒徑增大；隨著穩定劑用量的增加，聚苯乙烯微球 的粒徑減小。
[0014] 在基因組測序中，用于DNA文庫中核酸擴增的PS微球的粒徑一般為25微米，并且 要求單分散性好。但在PS微球制備方法中，分散聚合法制備的PS微球單分散性好，但微 球的粒徑較小，種子聚合法和懸浮聚合法雖然制備的PS微球粒徑較大，但微球的單分散性 差，分散系數高。因此在本領域中，制備粒徑為20至50微米的單分散PS微球一直存在著 上述問題。本發明通過大量試驗摸索并且意外發現，在一種特定的反應條件下，采用分散聚 合法成功制備出單分散PS微球，粒徑為25微米并且分散系數低。
【具體實施方式】
[0015] 下面將進一步的舉例說明本發明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發明要求 保護的技術方案的舉例說明，并非對這些技術方案的任何限制。本發明的保護范圍以所附 權利要求書記載的內容為準。
[0016] 實施例1聚苯乙烯微球的制備 向反應容器中加入230g的水、770g的乙二醇單甲醚、1. lg的聚乙烯醇、1. 54g的羥丙基 纖維素和1. 76g的聚乙二醇，通入氮氣保護，并在室溫下攪拌20分鐘至均相體系，然后加入 苯乙烯單體473g和偶氮二異丁腈0. 73g。升溫至75°C，恒溫反應8小時。反應結束，冷卻 至室溫，產品離心，并用乙醇反復洗滌，干燥，即得單分散PS微