低分子肝素-甘草次酸聚合物及其合成方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種納米聚合物自組裝膠束材料(低分子肝素-甘草次酸聚合物)的合成，尤其是指低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成及以該聚合物作為生物材料制備抗腫瘤藥物納米膠束制劑的應用方法。本發明屬于生物醫用材料和納米藥物制劑領域。
【背景技術】
[0002]幾十年來，惡性腫瘤的發生率和死亡率呈現明顯上升趨勢，成為嚴重威脅人類生命健康的多發病之一。有研宄預測至2050年僅亞太地區的惡性腫瘤新發病例和死亡人數便將達到730萬和550萬，是2000年的2倍以上。而其中肝癌被稱為“癌中之王”，其治愈率低，死亡率高。而我國是世界上肝癌的高發區，近20年來肝癌死亡率增加了 41.7%，全世界每年約有125萬人死于肝癌，其中近一半發生在我國。肝癌早期癥狀較為隱匿不易察覺，但一旦表現出明顯癥狀，其惡性程度高，發展迅速，若治療不及時或治療方案選擇不當，平均生存期僅為半年。目前，針對肝癌的臨床治療，為了彌補手術療法的不徹底性和易誘發轉移的缺點，化學療法作為輔助治療手段依然占據著非常重要的地位。然而，傳統的基于細胞毒性的化學治療藥物在通過全身給藥方式獲得治療效果的同時對人體正常的臟器也存在著較強的細胞毒性，繼而引發嚴重的毒副作用。例如紫杉醇是從紅豆杉屬植物中提取分離得到的一種天然抗癌活性成分。作為一種高效的細胞毒類抗癌藥，其臨床制劑泰素注射液曾長時間作為乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌以及急性白血病的一線藥物使用。但是其溶媒聚氧乙烯蓖麻油易產生諸如神經毒性、心臟毒性、腎毒性、過敏反應等毒副作用，加之紫杉醇的全身分布會導致嚴重的心臟毒性和腎毒性，因此如何在術后的肝癌患者身上運用溫和的、可耐受的化學治療手段以降低化學療法帶來的潛在危險是需要醫藥領域研宄人員需要亟需解決的問題。
[0003]納米給藥系統是近年來抗腫瘤藥物劑型開發和遞送領域的研宄熱點。它通過納米載體材料將化學藥物包裹或分散于納米級的基質當中，有效地改善難溶性藥物的溶解性，延長藥物在血液中的循環時間，改變藥物的體內分布，提高藥物生物利用度，并且具有一定的靶向性。這些優點可以有效降低化療過程中的非特異性不良反應，提高治療效能，尤為適用于腫瘤的治療。其中，聚合物膠束系統憑借其低毒性和良好的穩定性在難溶性藥物的增溶和遞送領域備受國內外學者關注。它是由兩親性的高分子聚合物在水中通過疏水基團的分子內和分子間作用力自發形成的一種具有典型核殼結構的自組裝結構。這種膠束系統由緊密的疏水內核和親水性的外殼組成，因其內核可以通過疏水作用力等包載一些難溶性藥物，因此該系統被認為是一種有前景的難溶性藥物的遞送載體。然而，這些納米給藥系統并不具備從網狀內皮系統逃逸的能力，在體內很容易被單核巨噬細胞吞噬而清除。另一方面，這種依靠制劑納米級粒徑實現的被動靶向依然存在腫瘤部位自聚物攝取不充分、甚至引發多藥耐藥從而降低療效的現象。為了完成腫瘤納米系統的靶向給藥，利用體內的特異性分子識別機制，在納米載體表面偶聯靶標分子已成為一種較為成熟的靶向策略。
[0004]早在20世紀90年代初，Negishi即證實了大鼠肝細胞膜組分中含有大量的甘草次酸結合位點，且呈現高度特異性。隨后以甘草次酸為靶標分子修飾的載體材料被國內外諸多學者所報道，比如，以甘草次酸作為疏水基團構建聚合物膠束系統的甘草次酸修飾的透明質酸聚合物和甘草次酸修飾硫酸酯殼聚糖聚合物；通過水溶性PEG長鏈將甘草次酸作為革巴向分子分布在聚合物表面的甘草次酸修飾的PEG - b-poly( γ-benzyl L-glutamate)聚合物膠束和甘草次酸修飾的殼聚糖/PEG納米粒等。結果顯示，該類載體材料具有顯著的肝靶向能力。因此以甘草次酸作為肝靶向介導基團可以研宄開發一類新型的甘草次酸介導的肝靶向納米給藥系統。中國專利CN101254308A公開了一種甘草次酸-聚乙二醇/殼聚糖肝靶向復合給藥系統及制備方法，并說明該靶向給藥系統對肝癌細胞有很強的結合能力；中國專利CN101642573A公開了一種殼聚糖基肝靶向納米粒子給藥系統及其制備方法，將甘草次酸作為靶標分子的同時作為疏水基團偶聯在硫酸酯殼聚糖或羧甲基殼聚糖上，從而構建形成肝靶向納米給藥系統；中國專利CN102336802A公開了甘草次酸修飾脂質、肝靶向脂質體、膠束及復合物和制法，將甘草次酸與磷脂或膽固醇在縮合劑條件下制得甘草次酸修飾的脂質，并以其為基本材料制備了甘草次酸介導的肝靶向脂質體和膠束載體。由此可見，甘草次酸作為靶向基團運用于肝靶向給藥系統構建已經受到廣大學者關注。
[0005]肝素主要是從牛肺或豬小腸粘膜中提取出來的一種動物粘多糖硫酸酯，因最初在肝臟中發現而得名。肝素主要是由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸等結構單元組成的水溶性長鏈大分子，平均分子量在12000Da左右。肝素因其與抗凝血酶獨特的結合能力早在1939年便已作為血液抗凝劑用于臨床研宄。不過，肝素的臨床應用也易引發諸如出血、血小板減少癥的出現，從而限制了其在醫藥領域的進一步應用。低分子肝素是普通肝素的降解產物。與普通肝素相比，低分子肝素在具有相似或者更優的抗凝血、抗炎、抗血管增生以及抗腫瘤特性的同時，其可能的不良反應顯著降低。因此，低分子肝素用于相關疾病治療更加安全可靠。低分子肝素因分子量小，骨架剛性降低而具有更加優良的水溶性。此外，肝素骨架中含有大量活潑的可修飾的游離基團，能夠通過化學修飾賦予其新的性能。因此肝素在除用作抗凝活性成分之外，以水溶性低分子肝素為基本骨架構架納米給藥系統吸引了眾多藥物制劑研宄工作者的關注。
[0006]近年來，對低分子肝素骨架進行疏水改性并在水性介質中構建聚合物膠束吸引了眾多醫藥領域專家學者的研宄興趣。通過化學手段將疏水性小分子引入肝素骨架中從而構建兩親性聚合物并誘使其在水性介質中發生自組裝聚合成為具有疏水內核的核殼結構膠束。但是通常情況下這些納米膠束系統并不具備從網狀內皮系統逃逸的能力，在體內很容易被單核巨噬細胞吞噬而清除。另一方面，這種依靠制劑納米級粒徑實現的被動靶向依然存在腫瘤部位自聚物攝取不充分、甚至引發多藥耐藥從而降低療效的現象。為了完成腫瘤納米系統的靶向給藥，利用體內的特異性分子識別機制，在納米載體構建過程中偶聯靶標分子已成為一種較為成熟的革E向策略。
[0007]綜上所述，以低分子肝素作為水溶性骨架材料構建聚合物膠束，在低分子肝素分子上引入甘草次酸進行疏水改性，使其具備在水性溶液中自組裝聚集的性能并利用其與肝癌實質細胞的特異性結合能力實現納米膠束的肝靶向藥物遞送。該設計方法在增加藥物溶解度，改變藥物在體內的分布，延長藥物在體內滯留時間的同時，并發揮甘草次酸修飾材料的靶向性能，其設計方法在腫瘤診斷和治療中具有很大的研宄開發前景。目前該設計尚未見相關報道。此外，運用抗癌藥物增敏劑同一線抗腫瘤藥物進行聯合用藥，逆轉單一長期用藥導致的多藥耐藥作用，增強抗腫瘤藥物的治療效果。
【發明內容】
[0008]針對上述現有技術，本發明提供了一種低分子肝素-甘草次酸聚合物，并提供了其合成方法，以及其作為生物可降解性材料用于制備抗腫瘤藥物肝靶向納米制劑的應用。
[0009]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0010]低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成方法，包括步驟如下:
[0011](I)低分子肝素-己二酸二酰肼的合成:將低分子肝素溶解于蒸餾水中，向其中依次加入己二酸二酰肼、1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、1-羥基苯并三氮唑，用氫氧化鈉調節反應體系PH = 6-7，室溫反應20-30小時，得低分子肝素-己二酸二酰肼；
[0012](2)甘草次酸丁二酸酯的合成:將甘草次酸溶于無水四氫呋喃中，加入丁二酸酐和4- 二甲氨基吡啶，避光室溫下攪拌20-30小時后，旋蒸除去有機溶劑，然后加入乙酸乙酯溶解，洗滌、純化得到甘草次酸丁二酸酯；
[0013](3)甘草次酸丁二酸酯活性酯溶液的制備:將甘草次酸丁二酸酯溶解于N，N 二甲基甲酰胺中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，于室溫攪拌3-5小時后，加入有機堿，得到甘草次酸丁二酸酯活性酯溶液；
[0014](4)低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成:將步驟⑴中所得的低分子肝素-己二酸二酰肼溶于蒸餾水中，攪拌使其充分溶脹、溶解，然后加入N，N 二甲基甲酰胺稀釋，備用；將步驟(3)中所得甘草次酸丁二酸酯活性酯溶液在強烈攪拌下滴入上述低分子肝素-己二酸二酰肼溶液中，室溫攪拌反應40-50小時，得到反應物溶液，反應溶液純化、冷凍干燥即得低分子肝素-甘草次酸聚合物。
[0015]上述合成方法中，步驟(I)中所述低分子肝素、蒸餾水、己二酸二酰肼、1-