用于基因打靶和性狀堆疊的工程化轉基因整合平臺(etip)的制作方法
【專利說明】用于基因打靶和性狀堆疊的工程化轉基因整合平臺 (ETIP)
[0001] 對相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年9月7日提交的美國臨時專利申請No. 61/697,882的優先權。 發明領域
[0003] 本公開文本涉及植物中的植物精確轉化、基因打靶、靶向基因組整合和蛋白質表 達的領域。在一個優選實施方案中，本公開文本描述了一種能在植物基因組中隨機地或在 靶定位置處插入的工程化轉基因整合平臺（ETIP)。
[0004] 發明背景
[0005] 為了應對食品生產日益增長的全球需求的挑戰，提高農業生產力（例如提高的產 量或工程化害蟲抗性）的典型辦法依賴于突變育種或通過轉化將新基因引入作物物種的 基因組。這些方法內在地是非特異性的且相對低效。例如，常規植物轉化方法投遞外源DNA， 它在隨機位置處整合入基因組。如此，為了鑒定及分離具有期望屬性的轉基因植物系，有必 要為每種構建物生成數以百計的獨特隨機整合事件，并隨后篩選期望個體。結果，常規植物 性狀工程是一項費力、費時、且不可預測的任務。而且，這些整合的隨機性質使得難以預測 是否由于非故意的基因組破壞而發生多效效應。
[0006] 當前轉化方法的隨機性質要求生成數以百計的事件來鑒定及選擇轉基因事件候 選（轉化和事件篩選相對于自功能基因組研宄鑒定的基因候選是限速的）。另外，根據基因 組內整合的位置，基因表達盒可以因基因組位置效應而以不同水平表達。這種基因組位置 效應使得比較使用常規轉化方法經隨機插入進入基因組的不同調節元件和轉基因設計的 影響高度可變。結果，具有工程化基因或性狀的植物系的生成、分離及表征成為極其費力且 費錢的方法，且成功概率低。
[0007] 精確基因修飾克服了植物系統中的常規實踐的后勤挑戰，而且成為基礎植物研宄 人員和農業生物工藝學家的一項長期目標。然而，除水稻中經正-負藥物選擇的"基因打 靶"或使用工程化前限制性位點外，所有植物物種（模型和作物二者）中的靶向基因組修 飾直到最近仍然證明是難以捉摸的。Teradaetal. (2002)NatBiotechnol20(10):1030; Teradaetal. (2007)PlantPhysiol144(2):846 ；D'HalIuinetal. (2008)Plant BiotechnologyJ. 6(1):93〇
[0008] 最近，用于靶向切割基因組DNA的方法和組合物已有描述。此類靶向切割事件 可用于例如誘導細胞DNA序列的靶向誘變或靶向刪除，或推動預定染色體基因座處的 靶向重組。參見例如美國專利公開文本2003/0232410, 2005/0208489, 2005/0026157， 2005/0064474 和 2006/0188987,和國際公開文本W02007/014275。
[0009] 美國專利公開文本No. 2008/0182332公開了非規范鋅指核酸酶（ZFN)用于靶向修 飾植物基因組的用途。美國專利申請No. 12/284, 888描述了ZFN介導的、進入植物EPSPS 基因座的靶向整合。然而，找到用于鑒定、選擇及快速推進穩定地、靶向地進入植物基因組 內精確位置的整合的組合物和方法的需要仍然存在。
[0010] 發明概述
[0011] 本公開文本的一個實施方案涉及一種用于生成轉基因植物細胞的方法。在又一個 實施方案中，提供了一種植物細胞，其具有包含可靶定核酸分子的基因組DNA。又一些實施 方案包括可靶定核酸分子，其包含：至少一個位點特異性核酸酶識別位點；第一標志物基 因的第一片段；和，第二標志物基因的第二片段。在另一個實施方案中，用供體核酸分子和 位點特異性核酸酶核酸分子轉化植物細胞。在一個后續實施方案中，在至少一個位點特異 性核酸酶識別位點內切割植物細胞的基因組DNA。一個另外的實施方案包括將供體核酸分 子整合入可靶定核酸分子（其中可靶定核酸分子內的整合包含至少一種功能性標志物基 因）以生成轉基因植物細胞，該轉基因植物細胞包含可靶定核酸分子和整合的、包含至少 一種功能性標志物基因的供體核酸分子。
[0012] 在還有另一個實施方案中，本公開文本涉及選自下組的油菜（Brassicanapus) 染色體靶位點：SEQIDN0:431 核苷酸 1-579 至SEQIDN0:432 核苷酸 166-732,SEQID NO:433核苷酸 1-550至SEQIDNO:434核苷酸 190-653,SEQIDNO:435核苷酸 1-298至SEQ IDNO: 436 核苷酸 51-644,SEQIDNO: 437 核苷酸 1-536 至SEQIDNO: 438 核苷酸 146-545， SEQIDN0:439 核苷酸 1-431 至SEQIDN0:440 核苷酸 167-685,SEQIDN0:441 核苷酸 1-599 至SEQIDN0:442 核苷酸 116-521，SEQIDN0:443 核苷酸 1-298 至SEQIDN0:444 核苷酸 193-775,和SEQIDNO:445 核苷酸 1-651 至SEQIDNO:446 核苷酸 120-578。
[0013] 在一個后續實施方案中，本公開文本涉及一種用于生成轉基因植物細胞的方法。 又一些實施方案包括可靶定核酸分子，其包含：至少一個位點特異性核酸酶識別位點；第 一標志物基因的第一片段；和，第二非編碼多核苷酸序列的第二片段。在另一個實施方案 中，用供體核酸分子和位點特異性核酸酶核酸分子轉化植物細胞。在一個后續實施方案中， 在至少一個位點特異性核酸酶識別位點內切割植物細胞的基因組DNA。一個另外的實施方 案包括將供體核酸分子整合入可靶定核酸分子（其中可靶定核酸分子內的整合包含至少 一種功能性標志物基因）以生成轉基因植物細胞，該轉基因植物細胞包含可靶定核酸分子 和整合的、包含至少一種功能性標志物基因的供體核酸分子。
[0014] 根據下述數個實施方案的詳細描述，上述和其它特征會變得更加明顯，這參照附 圖進行。
[0015] 附圖簡述
[0016]圖1A-1E:顯示FAD2基因序列的序列比對，這是使用AlignX?生成的。
[0017] 圖2:顯示FAD2基因序列的系統發生樹，這是使用JalvieWTMV2. 3基于鄰居連接距 離生成的。
[0018]圖3A-3M'：顯示FAD3基因序列的序列比對，這是使用AlignX:U^成的。
[0019] 圖4:顯示FAD3基因序列的系統發生樹，這是使用JalvieWTMV2. 3基于鄰居連接距 離生成的。標記的序列對應下述各項：FAD3A' /A"貫穿本申請描述為FAD3A' ；單元型2貫 穿本申請描述為FAD3C';單元型1貫穿本申請描述為FAD3C";和，單元型3貫穿本申請描述 為FAD3A"。
[0020] 圖5 :顯示pDAB104010的質粒圖并呈現一種代表性鋅指核酸酶（ZFN)表達盒。這 種構建物的布局對其它ZFN表達盒是相似的，其中鋅指域（24828和24829)與下文描述的 備選鋅指域交換。
[0021] 圖6:是一幅例示性多線圖，顯示每10, 000個序列讀出中在靶ZFN位點處具有刪 除的序列讀出的數目。圖上的X軸表示刪除的堿基的數目，Y軸表示序列讀出的數目，而Z 軸表示顏色編碼的樣品身份，如圖右邊描述的。顯示的具體例子是含有3個靶ZFN位點（A、 B和C)的FAD2基因家族基因座1的，評估四個基因家族成員和兩個對照轉染（作為對照樣 品A和B)。從頂部到底部（圖例頂部的A-對照_FADA'至圖例底部的C_樣品_FAD2C)列 出的線在圖上從距標記的X軸最近的（A_對照_FADA'）到距標記的X軸最遠的（(：_樣品_ FAD2C)顯示。
[0022] 圖7 : (A)該圖展示來自靶向FAD2基因家族基因座4的ZFN的數據。該基因座含 有兩個ZFN位點和兩個必需的對照轉染。圖7 :(B)ZFN靶位點周圍的具體序列背景（SEQID N0:471-480)，鑒定含有C、T和G的三核苷酸重復的FAD2A和C，導致經由FAD2A和C基因 座測序觀察到的單堿基刪除增多。
[0023] 圖8 :顯示pDAS000130的質粒圖。
[0024] 圖9:顯示pDAS000271的質粒圖。
[0025] 圖10:顯示pDAS000272的質粒圖。
[0026] 圖11:顯示pDAS000273的質粒圖。
[0027] 圖12:顯示pDAS000274的質粒圖。
[0028] 圖13:顯示pDAS000275的質粒圖。
[0029] 圖14:顯示pDAS000031的質粒圖。
[0030] 圖15:顯示pDAS000036的質粒圖。
[0031] 圖16:顯示pDAS000037的質粒圖。
[0032] 圖17:圖示一種ETIP和有效載荷核酸構造，以及植物細胞基因組中ETIP位點處 的靶定有效載荷的產物。
[0033] 圖18:圖示原生質體細胞的轉化，接著是使用3'和5'端二者處的截短型可評分 和可選擇標志物的重建，宿主系中ETIP處的靶定有效載荷DNA的FACS選擇。
[0034] 圖19A-B:圖示ETIP蕓苔事件的同源性定向修復，其源自鋅指核酸酶（pDAS000074 或PDAS000075)對基因組基因座的雙鏈DNA切割及后續的Ds-red供體（pDAS000068、 PDAS000070、或pDAS000072)進入蕓苔染色體ETIP基因座的整合。供體整合入基因組基因 座產生完全功能性、高表達Ds-red轉基因。
[0035] 圖20:顯示蕓苔原生質體的FACS分選和用pDAS000031 ('pDAS31'）轉染的蕓苔原 生質體的計算轉染效率。另外，提供未轉化蕓苔原生質體的FACS分選結果作為陰性對照。
[0036] 圖21:顯示蕓苔原生質體的FACS分選和用pDAS000064/pDAS000074(頂部圖）和 pDAS000064/pDAS000075 (底部圖）轉染的蕓苔ETIP原生質體事件的計算轉染效率。
[0037] 圖22:顯示蕓苔原生質體的FACS分選和用pDAS000068/pDAS000074(頂部圖）和 pDAS000068/pDAS000075 (底部圖）轉化的蕓苔ETIP原生質體事件的計算轉染效率。
[0038] 圖23:顯示蕓苔原生質體的FACS分選和用pDAS000070/pDAS000074(頂部圖）和 pDAS000070/pDAS000075 (底部圖）轉化的蕓苔ETIP原生質體事件的計算轉染效率。
[0039] 圖24:顯示蕓苔原生質體的FACS分選和用pDAS000072/pDAS000074(頂部圖）和 pDAS000072/pDAS000075 (底部圖）轉化的蕓苔ETIP原生質體事件的計算轉染效率。
[0040] 圖25:顯示pDAS000074的質粒圖。
[0041] 圖26 :顯示pDAS000075的質粒圖。
[0042] 圖27 :顯示pDAS000064的質粒圖。
[0043] 圖28 :顯示pDAS000068的質粒圖。
[0044] 圖29 :顯示pDAS000070的質粒圖。
[0045] 圖30 :顯示pDAS000072的質粒圖。
[0046] 圖31:是一幅示意圖，顯示用于轉基因拷貝數評估測定法的轉基因靶引物和探針 的結合位點。
[0047]圖 32 :顯示一份Sequencher文件，顯示FAD2AZFNDNA識別域（bcl2075_ Fad2a-r272a2 和bcl2075_Fad2a-278a2)，和ZFN特異性引物（FAD2A.UnE.Fl和FAD2A.UnE. Rl)和內源引物（FAD2A/2C.RB.UnE.Fl和FAD2A/