人單克隆抗體結合/中和b型肉毒桿菌神經毒素的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及抗肉毒桿菌神經毒素（botulinum neurotoxin)(肉毒毒素 (botul in))的抗體以及使用和制造它們的方法。
[0002] [相關申請]
[0003] 本申請要求2012年8月31日遞交的美國臨時專利申請No. 61/695318的權益，該 申請在此通過援用將其全文并入。
【背景技術】
[0004] 肉毒桿菌神經毒素是已知的最有毒的物質。這些毒素可以導致肉毒中毒 (botulism)，由各種細菌包括肉毒梭狀芽胞桿菌（Clostridium botulinum)產牛。產生肉 毒桿菌毒素的梭狀芽孢桿菌是厭氧性革蘭氏陽性菌。這些細菌形成孢子，并且通常分布在 環境中。在分子水平上，肉毒中毒是通過由毒素在神經肌肉接點引起的乙酰膽堿釋放的抑 制導致的。已經確定7種毒素血清型仏、8、(：、04、？和6)。它們具有對應于包括100-1^ & 重鏈和50-kDa輕鏈的大約150kD的鋅內肽酶蛋白的相似的結構。毒素血清型A、B、E和F 通常與人類中肉毒中毒相關。
[0005] 肉毒中毒可以分成不同類別-食源性、傷口感染、嬰兒腸毒血癥、成人腸毒血癥、 毒素注射（醫源性肉毒中毒）和武器化毒素。食源性疾病是由于攝取被產生毒素的細菌污 染的食物中的毒素而發生。在傷口感染中，傷口聚集產毒梭狀芽胞桿菌，然后其在傷口中生 長和產生毒素。在嬰兒肉毒中毒中，嬰兒腸道聚集產毒梭狀芽胞桿菌，然后其產生毒素。成 人腸毒血癥類似于嬰兒肉毒中毒。美容或治療注射肉毒桿菌毒素有時可能導致肉毒中毒。 肉毒中毒也可以產生于武器化毒素造成的傷害，例如，通過吸入氣霧化的肉毒桿菌毒素。
[0006] 肉毒中毒的特點是對稱顱神經麻痹，接著隨意肌遞減對稱弛緩性癱瘓。這種癱瘓 導致失去呼吸和死亡。毒素結合是不可逆的。恢復涉及新神經末梢的生長。恢復可能是漫 長的，并涉及延長的門診康復治療。與毒素接觸后，該疾病的發作可以是迅速的。治療通常 涉及施用抗毒素，它可以幫助限制癱瘓的程度。可用的大多數抗毒素是馬源性的，并且不一 定是專用于特定類型的肉毒桿菌神經毒素的。存在對更有針對性的形式的抗毒素的需要。 還有對沒有副作用如血清病的有效的毒素中和抗體的需要。考慮到肉毒中毒發展如此之 快，進一步存在對更好的診斷測試的需要。
[0007] 引用列表
[0008] 非專利文獻
[0009] [非專利文獻 1] Arimitsu 等，Infect. Immun. 71 :1599-1603, 2003
【發明內容】
[0010] (技術問題）
[0011] 因此，本發明的一個特征是提供具有卓越功效和安全性的抗肉毒桿菌神經毒素的 治療性抗體。
[0012] 本發明的另一個特征是提供抑制和治療肉毒中毒的方法。
[0013] 本發明的進一步的特征是提供沒有副作用如血清病的治療劑。
[0014] 本發明的另外的特征和優點將在下面的說明書中部分闡述，并且部分根據說明書 將是明顯的，或者可以通過本發明的實施而得知。本發明的目的和其它優點將通過在說明 書和所附的權利要求中特別指出的要素和組合來實現和達到。
[0015] (解決技術問題的技術方案）
[0016] 為了實現這些和其它優點，并且根據本發明的目的，如這里具體實施的和廣泛描 述的，本發明涉及分離的抗B型肉毒桿菌神經毒素單克隆抗體或其抗原結合片段，具有抗B 型肉毒桿菌神經毒素的中和活性。單克隆抗體可以包括人單克隆抗體、人源化單克隆抗體、 或兩者。分離的抗B型肉毒桿菌神經毒素單克隆抗體或其抗原結合片段可以具有抗B型肉 毒桿菌神經毒素的前體毒素的中和活性。分離的抗B型肉毒桿菌神經毒素單克隆抗體或其 抗原結合片段可以具有對B型肉毒桿菌神經毒素（botulinum neurotoxin type B，BoNT/ B)的輕鏈的特異性結合活性或具有對B型肉毒桿菌神經毒素（BoNT/B)的輕鏈和重鏈兩者 的特異性結合活性。本發明還提供產生本發明的抗體或其片段的雜交瘤（Hybridomas)，以 及形成這樣的雜交瘤的方法，和從這樣的雜交瘤產生抗體或其片段的方法。
[0017] 本發明還涉及藥物組合物。藥物組合物可以包含一種或多種分離的抗B型肉毒桿 菌神經毒素單克隆抗體和其抗原結合片段以及藥學上可接受的載體。本發明提供用于預 防、治療和檢測人類受試者中B型肉毒桿菌神經毒素中毒中的至少一種的試劑盒。試劑盒 可以包括本發明的分離的抗B型肉毒桿菌神經毒素單克隆抗體、其抗原結合片段、或兩者。 本發明還提供分離的抗B型肉毒桿菌神經毒素單克隆抗體、其抗原結合片段、或兩者用于 制備用于抑制或治療人類受試者中肉毒中毒的藥物的用途。
[0018] 本發明還涉及抑制或治療人類受試者中肉毒中毒的方法。方法可以包括對人類受 試者施用治療有效量的分離的抗B型肉毒桿菌神經毒素單克隆抗體、其抗原結合片段、或 兩者。方法還可以包括診斷患者肉毒桿菌神經毒素中毒。方法可以包括監測肉毒中毒的至 少一種癥狀的減少。抑制或治療人類受試者中肉毒中毒的方法可以包括施用分離的抗B型 肉毒桿菌神經毒素單克隆抗體、其抗原結合片段、或兩者并聯合針對肉毒中毒的一種或多 種另外的治療。聯合可以協同作用以抑制或治療肉毒中毒。
[0019] 本發明還涉及檢測人類受試者中B型肉毒桿菌神經毒素的方法。方法可以包括將 來自人類受試者的樣品與分離的抗B型肉毒桿菌神經毒素單克隆抗體、其抗原結合片段、 或兩者接觸。方法還可以包括基于抗體、其片段、或兩者是否結合B型肉毒桿菌神經毒素而 檢測人類受試者中B型肉毒桿菌神經毒素的存在或不存在。
[0020] 應理解，前面的一般描述和后面的詳細描述都只是示例性的和說明性的，旨在提 供對要求保護的本發明的進一步解釋。
[0021] 附圖包含在本申請中并組成本申請的一部分，說明本發明的一些具體實施例，并 且與說明書一起用于解釋本發明的原理。
[0022] 附圖簡要說明
[0023] 圖1是示出根據本發明的志愿者如何進行免疫以及產生抗體的細胞如何進行分 離的示意圖。
[0024] 圖2是描繪根據本發明的細胞融合和克隆時間表的流程圖。
[0025] 圖3示出根據本發明的M-2抗體的重鏈的核苷酸序列和氨基酸序列。
[0026] 圖4示出根據本發明的M-2抗體的輕鏈的核苷酸序列和氨基酸序列。
[0027] 圖5示出根據本發明的M-4抗體的重鏈的核苷酸序列和氨基酸序列。
[0028] 圖6示出根據本發明的RM-4LC-16抗體的輕鏈的核苷酸序列和氨基酸序列。
[0029] 圖7示出根據本發明的RM-4LC-18抗體的輕鏈的核苷酸序列和氨基酸序列。
[0030] 圖8示出根據本發明的RM-4LC-19抗體的輕鏈的核苷酸序列和氨基酸序列。
[0031] 圖9包括顯示根據本發明的人單克隆抗體結合BoNT/A或BoNT/B的折線圖。人單 克隆抗體（HuMAb)結合BoNT通過ELISA進行分析。HuMAbs (約0. 05-1. 0微克/毫升）加 至包被有BoNT/A或BoNT/B的板。洗滌后，結合的HuMAbs通過偶聯HRP的抗人IgG抗體進 行檢測。M-2和M-4表現出對BoNT/B的特異性結合。
[0032] 圖10包括根據本發明的用于人單克隆抗體的表位作圖的西方轉漬（Western blot)分析。BoNT通過SDS-PAGE分離成He和Lc，并轉移到硝酸纖維素膜上。HuMAbs (1. 0 微克/毫升）加至該膜，并在室溫下溫育1小時。洗滌后，將膜與偶聯HRP的抗人IgG抗體 在室溫下溫育1小時，然后特異性條帶通過ECL可視化。M-2特異性結合BoNT/B的輕鏈。 相比之下，M-4結合輕鏈和重鏈兩者。
[0033] 圖11是顯示根據本發明的人單克隆抗體結合BoNT/B、前體毒素、和無毒成分的柱 狀圖。HuMAb結合BoNT、前體毒素（12S毒素和16S毒素）或無毒成分（NAP-16)通過ELISA 進行分析。HuMAbs加至包被有BoNT、前體毒素或NAP-16的板。洗絳后，結合的HuMAbs通 過偶聯HRP的抗人IgG抗體進行檢測。M-2和M-4結合BoNT和前體毒素。相比之下，M-2 和M-4顯示對NAP-16的微弱結合。這些結果表明M-2和M-4結合前體毒素中的BoNT、以及 單獨的BoNT，并表明M-2和M-4特異性結合BoNT。
[0034] 圖12是顯示根據本發明的人單克隆抗體的聯合對BoNT/B的中和活性的折線圖。 IOLD 5tl的BoNT/B與M-2和M-4 (每種0. 05、0. 1或0. 5微克）的混合物溫育并注射到小鼠 中。所有接受M-2 (0. 5微克）和M-4 (0. 5微克）的混合物的小鼠均存活且沒有癥狀。
[0035] 圖13是示出根據本發明的人單克隆抗體施用后的對前體毒素（16S毒素）的中和 活性的折線圖。對小鼠口服施用前體毒素（16S毒素，10納克），隨后在口服施用16S毒素 后12、24或36小時通過腹腔內注射（i. p. injection)施用HuMAbs(M-20. 5微克+M-4 0. 5 微克）。那些沒有用HuMAbs處理的對照小鼠在72小時內死亡。相比之下，HuMAbs的暴露 后治療在口服施用16S毒素后12小時提供了完全存活，在施用后24小時和36小時提供了 部分存活。
[0036] 圖14包括顯示根據本發明的人單克隆抗體結合和中和BoNT/B2(菌株111)和 BoNT/B6(菌株0saka05)的柱形圖和折線圖。HuMAbs(M-2和M-4)結合BoNT/B2(菌株111) 和BoNT/B6 (菌株0saka05)是通過ELISA進行分析。HuMAbs (0. 5微克/毫升）加至包被有 BoNT的板。洗滌后，結合的HuMAbs通過偶聯HRP的抗人IgG抗體進行檢測。M-2和M-4顯 示除了對BoNT/Bl外還對BoNT/B2和BoNT/B6強力結合。在中和試驗中，M-2+M-4(0. 5微 克+〇? 5微克）完全中和BoNT/B2 (10納克）和BoNT/B6 (2. 5納克）。
[0037] 圖15包括顯示根據本發明的重組人單克隆抗體結合BoNT/B的西方轉漬分析和折 線圖。用LIP0FECTAMINE 2000轉染試劑將pQCXIP-hCH和pQCXIH-hCl表達載體瞬時轉染 HEK293細胞。培養上清液中的重組HuMAbs用偶聯HRP的抗人IgG進行測定。重組M-2 (RM-2) 和重組M-4 (RM-4)結合BoNT/B是通過ELISA進行分析。重組HuMAb (約0. 01-0. 5微克/ 毫升）加至包被有BoNT/B的板。洗滌后，結合的重組HuMAbs通過偶聯HRP的抗人IgG抗 體進行檢測。RM-2和RM-4以與來源于雜交瘤的M-2和M-4相同的方式結合BoNT/B。
[0038] 圖16包括對來源于雜交瘤的HuMAbs和重組HuMAbs (RM-2和RM-4)與BoNT/ B(BoNT/Bl、BoNT/B2 或 BoNT/B6)的結合進行西方轉漬分析。BoNT/Bl、BoNT/B2 或 BoNT/B6 通過SDS-PAGE分離成He和Lc，并轉移到硝酸纖維素膜上。HuMAbs (I. 0微克/毫升）加 至該膜，并在室溫下溫育1小時。洗滌后，將膜與偶聯HRP的抗人IgG抗體在室溫下溫育1 小時，然后特異性條帶通過ECL可視化。重組HuMAbs顯不與來源于雜交瘤的HuMAbs相同 的結合輪廓。M-2和RM-2特異性結合BoNT/B的輕鏈。相比之下，M-4和RM-4(RM-4LC16， RM-4LC18，RM-4LC19具有相同的M-4的重鏈）結合到輕鏈和重鏈兩者。通過M-4和RM-4抗 體，B2亞型的重鏈比Bl的重鏈檢測得更加清楚。另外，B6亞型的重鏈比B2的重鏈檢測得 更加清楚。
【具體實施方式】
[0039](本發明的詳細描述）
[0040] 根據本發明，提供一種分離的抗B型肉毒桿菌神經毒素單克隆抗體或其抗原結合 片段，具有抗B型肉毒桿菌神經毒素的中和活性。單克隆抗體可以包括人單克隆抗體、人 源化單克隆抗體、或該兩者。分離的抗B型肉毒桿菌神經毒素單克隆抗體或其抗原結合片 段可以具有抗B型肉毒桿菌神經毒素的前體毒素的中和活性。分離的抗B型肉毒桿菌神 經毒素單克隆抗體或其抗原結合片段可以具有抗由B型肉毒梭狀芽胞桿菌的BoNT/Bl(菌 株Okra)、B姻肉毒梭狀芽朐桿菌的BoNT/B2(菌株111)、B姻肉毒梭狀芽朐桿菌的BoNT/ B6(菌株0saka05)、或其任意組合產生的B型肉毒桿菌神經毒素的中和活性。因此分離的 抗B型肉毒桿菌神經毒素單克隆抗體或其抗原結合片段可以具有對B型肉毒桿菌神經毒素 (BoNT/B)的輕鏈的特異性結合活性。
[0041] 抗體或其片段可以使用任何合適的技術產生。例如，分離的抗B型肉毒桿菌神經 毒素單克隆抗體可以通過雜交瘤產生，該雜交瘤通過融合來自用B型肉毒桿菌神經毒素免 疫的人的外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC)和能夠有效細胞 融合的融合伴侶細胞進行制備。B型肉毒桿菌神經毒素可以是B型肉毒梭狀芽胞桿菌的 BoNT/B 1 (菌株Okra)、B姻肉毒梭狀芽朐桿菌的BoNT/B2 (菌株111)、B姻肉毒梭狀芽朐桿 菌的B〇NT/B6 (菌株0saka05)、或其任意組合的產物。可以使用任何合適的融合伴侶細胞， 例如SPYMEG細胞。
[0042] 本發明還提供產生本發明的抗體或其片段的雜交瘤。例如，雜交瘤可以具有NITE BP-01639或NITE BP-01640的保藏號。還提供分離的單克隆抗體，由具有NITE BP-01639或 NITE BP-01640保藏號的雜交瘤產生。如上所述獲得的單克隆抗體的例子包括由名為"雜交 瘤M-2(M1E9)"（ "Hybridoma M-2(M1E9)"）的雜交瘤產生的單克隆抗體（以下，簡稱為M-2 抗體）和由名為"雜交瘤M-4(M4C9)"（ "Hybridoma M-4(M4C9)"）的雜交瘤產生的單克隆 抗體（以下，簡稱為M-4抗體）。這些雜交瘤于2013年6月26日以保藏號NITE BP-01639 和NITE BP-01640保藏在獨立行政法人制品評價技術基盤機構專利微生物保藏中心（the NITE Patent Microorganisms Depositary， National Institute of Technology and Evaluation)(日本千葉縣木更津市上總廉足2-5-8,122號室，郵編292-0818)。然后，根據 布達佩斯條約，它們以相同的保藏號轉移為國際保藏。
[0043] 分離的抗B型肉毒桿菌神經毒素單克隆抗體或其抗原結合片段可以是IgG、IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgAl、IgA2、IgD、IgE、其任何片段、或者其任意組合。抗體片 段