一種基于抗體磁珠捕獲的流感病毒檢測前處理方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種流感病毒檢測的前處理方法，特別是一種基于抗體磁珠捕獲的流感病毒檢測前處理方法。
【背景技術】
[0002]流行性感冒病毒(Influenza virus)，是正粘病毒科的代表種，包括人流感病毒和動物流感病毒。其中人感染甲型流感病毒傳染性強、感染率高。在世界范圍內，每年度流感流行造成約300萬至500萬例重癥病例，其中死亡約25萬至50萬人。流感病毒的快速鑒定是應對和防控流感大流行的關鍵要素。在第一時間鑒定和明確新型流感病毒，了解病毒的來源和相關特征，有助于快速評估病毒的傳播風險和健康危害，為疫情的及時有效控制提供重要的科學支撐。
[0003]流感病毒的實驗室診斷方法主要有病毒分離培養，血清學診斷，抗原檢測和病毒核酸檢測。其中病毒核酸檢測有PCR、實時熒光PCR(real-time PCR)、等溫擴增等技術。由于具有速度快、通量高、靈敏度高、特異性強等突出優勢，各國通常均以real-time PCR為最主要手段，輔助病毒分離培養和血清學檢測流感病毒【1，2】。
[0004]雖然real-time PCR方法檢測靈敏度高于其他檢測手段，但有不少研宄也指出，現行的real-time PCR方法仍存在敏感度不足的問題。部分樣本使用磁珠法或離心柱法提取樣本總核酸(或病毒核酸)后，檢測結果處于陽性和陰性之間的“灰區”，還有部分樣本當其檢測呈陰性結果時，仍不能排除病人未感染流感病毒。此類現象的原因可能是患者處于感染初期或恢復期，導致樣本中病毒含量過低，或臨床樣本中殘存抑制擴增檢測的物質等。因此需要使用適宜的方法對流感病毒進行富集濃縮。
[0005]目前應用的病毒富集方法主要有以下幾類:(I)紅細胞富集流感病毒法:利用醛化的紅細胞凝集流感病毒，并在37°C解離釋放病毒，達到富集流感病毒的目的。但該方法的富集效率較低。(2)流感病毒血凝素(Hemagglutinin, HA)抗體磁珠富集法:以磁珠為載體，表面包被抗HA抗體，HA抗體磁珠在生物樣本中與流感病毒結合后，在外加磁場的作用下發生定向移動，從而達到濃縮分離的目的。該方法一次只能富集一種亞型流感病毒，只能用于病毒顆粒的富集，且制備價格昂貴。(3)唾液酸胎球蛋白磁珠富集法:將HA抗體磁珠富集法中的HA抗體更換為唾液酸胎球蛋白，利用流感病毒與其結合的能力實現濃縮富集。該方法可用于各亞型病毒，但特異性不高【5】。
[0006]參考文獻
[0007]【I】Wesenbeeck LV, Meeuws H, Immerseel AV, Ispas G, Schmidt K, HouspieL, et al.Comparison of the FilmArray RP, Verigene RV+, and Prodesse ProFLU+/FAST+multiplex platforms for detect1n of influenza viruses in clinical samplesfrom the 2011-2012influenza season in Belgium.J Clin Microb1l2013 ；51:2977-85.
[0008]【2】FreyKG, Herrera-Galeano GE, Redden CL, Luu TV, Servetas SL, MateczunAJ, et al.Comparison of three next-generat1n sequencing platforms formetagenomic sequencing and identificat1n of pathogens in blood.BMCGenomics2014 ； 15:96.
[0009]【3】Centers for Disease Control and Prevent1n.Evaluat1n of rapidinfluenza diagnostic tests for detect1n of novel influenza A (HlNl) Virus-UnitedStates, 2009.MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2009 ;58:826-9.
[0010]【4】HatchetteTFj Drews SJ，Bastien N，Li Yj German G，et al.Detect1n ofInfluenza H7N9Virus:All Molecular Tests Are Not Equal.J Clin Microb1l2013 ；51:3835-8.
[0011]【5】夏志平.一種以含唾液酸胎球蛋白磁珠富集流感病毒的方法:中國，201310165956.2[P], 2013-05-08.。
【發明內容】
[0012]針對上述現有技術中存在的不足，本發明提供了一種基于抗體磁珠捕獲的流感病毒前處理方法，該方法操作簡便、快速、富集效率高、選擇特異性好、適用于多種樣本。
[0013]本發明提供的一種基于抗體磁珠捕獲的流感病毒前處理方法，包括:用1-(3- 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺活化羧基磁珠，然后將甲型流感病毒M2e單克隆抗體和/或乙型流感病毒M2單克隆抗體共價偶聯在活化的羧基磁珠上，再用偶聯后得到的抗體磁珠與待測生物樣本混合，富集流感病毒。
[0014]進一步地，該前處理方法包括如下步驟:
[0015](I)對貯存在保存液中的羧基磁珠進行震蕩分散，使其分散為均一懸濁液；
[0016](2)向羧基磁珠懸濁液中加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽，在2-6°C下震蕩反應25-35分鐘；更優選地使在4°C下震蕩反應30分鐘；
[0017](3)在步驟⑵得到的混合體系中加入N-羥基琥珀酰亞胺，在2-6°C下反應6小時，得到活化羧基磁珠；更優選地溫度為4°C ;
[0018](4)將活化羧基磁珠加入到流感病毒M2e單克隆抗體的蛋白溶液中，在2_6°C下震蕩反應8小時，得到抗體磁珠；更優選地為4°C ；
[0019](5)對抗體磁珠進行洗滌，然后在2-6 °C下保持2個月；更優選地為4°C ;
[0020](6)將抗體磁珠加入到待測生物樣本中，震蕩條件下混合，進行流感病毒和流感病毒感染細胞的濃縮富集。
[0021]優選地，所述流感病毒單克隆抗體的蛋白溶液的制備方法為:1單位質量的流感病毒單克隆抗體，使用1.5單位質量的pH7.4的PBS緩沖液稀釋，獲得流感病毒單克隆抗體的蛋白溶液。
[0022]優選地，步驟(I)中的震蕩分散采用渦旋振蕩儀進行，轉速為3000rpm。
[0023]優選地，所述震蕩反應采用渦旋振蕩儀進行，轉速為300rpm。
[0024]進一步地，上述前處理方法還包括:
[0025](7)對濃縮富集流感病毒后的抗體磁珠進行洗滌。
[0026]優選地，步驟(2)中羧基磁珠與1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽的質量比為1:20。
[0027]優選地，N-羥基琥珀酰亞胺的加入量為:步驟⑵得到的混合體系中每含6mol的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，需要加入Imol的N-羥基琥珀酰亞胺。
[0028]優選地，步驟(4)中活化羧基磁珠與流感病毒M2e單克隆抗體的質量比為1:0.10-0.15。
[0029]優選地，步驟(6)中抗體磁珠的加入量為50 μ g
[0030]本發明提供的一種基于抗體磁珠捕獲的流感病毒前處理方法，其原理是根據流感病毒及被流感病毒感染的宿主細胞表面都展示有流感病毒基質蛋白胞外區(Matrixprotein 2external domain, M2e)蛋白的特性，將抗流感病毒M2e和或M2抗體共價偶聯在活化磁珠上，將偶聯后的抗體磁珠與待測生物樣本混合孵育，再通過外加磁場的作用分離富集濃縮的流感病毒。該方法實現了流感病毒和病毒感染細胞的同步富集濃縮，在濃縮的同時實現了擴增檢測抑制物質的去除。適用于各種亞型的流感病毒，適用于各類低病毒載量生物樣本。操作簡便，適應于多種流感病毒樣本，特異性強，靈敏度高，成本較低。
【附圖說明】
[0031]圖1為實施例1及其陽性對照組、陰性對照組的實時熒光反轉錄PCR檢測擴增曲線圖；圖1中I為甲型HlN109pdm亞型陽性對照；2為甲型HlN109pdm亞型檢測樣本(實施例I) ;3為甲型H3N2亞型檢測樣本(實施例1) ;4為甲型H3N2亞型陽性對照；5為甲型HlN109pdm亞型陰性對照；6為甲型H3N2亞型陰性對照。
[0032]圖2為實施例2及其陽性對照組、陰性對照組的實時熒光反轉錄PCR檢測擴增曲線圖；圖2中I為乙型流感病毒檢測樣本；2為乙型流感病毒陽性對照；3為乙型流感病毒陰性對照。
[0033]圖3為實施例3實時熒光反轉錄PCR檢測擴增曲線圖；圖3中I為甲型H3N2亞型檢測陽性；2為甲型HlN109pdm亞型檢測陰性；3為甲型H5N1亞型檢測陰性；4為甲型H7N9檢測陰性；5為陰性對照。
【具體實施方式】
[0034]為了使本技術領域的人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合【具體實施方式】對本發明作進一步的詳細說明。
[0035]本發明各實施例中的羧基磁珠為超順磁珠，由市售渠道直接購得，甲型流感病毒M2e單克隆抗體與乙型流感病毒M2單克隆抗體購自美國Sigma公司。
[0036]實施例1
[0037]甲型HlN109pdm亞型或甲型H3N2亞型流感病毒咽拭子樣本前處理
[0038](I)使用渦旋振蕩儀震蕩(條件3000rpm，時間5分鐘)羧基化超順磁珠，使其完全分散為均一懸濁液。
[0039](2)在0