檢測pdgfra基因d842v多態性位點的引物、試劑盒及其pcr方法

檢測pdgfra基因d842v多態性位點的引物、試劑盒及其pcr方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學基因檢測領域，特別提供了一種檢測roGFRA基因D842V多 態性位點的引物、試劑盒及其PCR方法，用于TOGFRA基因D842V多態性位點的快速檢測。
【背景技術】
[0002] 血小板衍生生長因子（PDGF)是一種促血管生成因子，H)GF是多種間質細胞如成 纖維細胞、血管平滑肌細胞、腎小球血管細胞、神經膠質細胞、內皮細胞等的強效促有絲分 裂原和重要的血管生長因子，由血小板，組織細胞和某些腫瘤細胞產生。血小板衍生生長因 子受體（PDGFR)是一種受體酪氨酸蛋白激酶家族成員，能夠促進細胞的趨化、分裂與增殖， 在機體生長發育、創傷修復等生理過程中起積極重要的作用，并與腫瘤的發生密切相關。 TOGFRA是TOGFR的一種，在促進腫瘤細胞的增殖、侵襲及血管生成等方面發揮重要作用。 TOGFR通路的激活涉及關鍵的下游信號通路，包括RAS-MAPK途徑和PI3K途徑等。
[0003]TOGFRA基因由人類第4號染色體基因編碼（4ql2)，TOGFRA基因全長約65kb，由 23個外顯子組成，其中外顯子3~10編碼胞外的5個免疫球蛋白樣區域，外顯子11編碼 跨膜區，外顯子13~15和外顯子17~21分別編碼胞內的2個酪氨酸激酶區。TOGFRA基 因編碼的蛋白質是血小板衍生生長因子受體a (platelet2derivedgrowthfactorrecep toralpha，TOGFRA)，TOGFRA為一種單鏈跨膜糖蛋白，由1089個氨基酸組成，593~954位 屬于酪氨酸激酶區。
[0004] I^DGFRA基因突變常發生于12號外顯子和18號外顯子。伊馬替尼（格列衛， Gleevec)作用于TOGFR下游的酪氨酸激酶，臨床研宄顯示伊馬替尼用于治療胃腸道間質 瘤、腦瘤和黑色素瘤效果顯著，但TOGFRA基因外顯子18的D842V突變會導致胃腸道間質瘤 患者對伊馬替尼原發耐藥。胃腸道間質瘤患者中約7%的病例攜帶TOGFR基因突變，其中 1/3病例有TOGFRA突變，突變主要發生在編碼活性結構域的外顯子18上，且TOFGR a基因 突變與C-KIT基因突變是相互獨立的。選擇靶向藥物治療癌癥的患者應進行該基因的突變 檢測，以幫助醫生了解患者是否會對單抗類藥物產生耐藥性。
[0005] 目前對基因突變和基因多態性的檢測，常見有直接測序法；基因芯片雜交法； PCR-RFLP方法；PCR擴增產物毛細管電泳分析法；PCR-SSCP;PCR高分辨熔解曲線分析技 術；PCR-TaqmanMGB(MinorGrooveBinder)探針法；AS-PCR法；Cast-PCR法等。這些方 法或多或少還存在儀器價格高，操作難度大，存在一定假陰性和假陽性，檢測成本高，臨床 普及程度低，不能同時大規模檢測臨床標本等缺點。
[0006]如：1)直接測序法是突變分析的金標準，能發現已知和未知突變位點，但該法檢測 基因突變的靈敏度為20%(即目的基因的突變基因DNA模板數占野生型DNA模板數的20%)。 同時還存在操作復雜，周期長，分析速度慢，常需要2天的時間，而且該法是開管操作，大大 增加污染的可能性，不適合對大規模標本的檢測，同時還需要昂貴的儀器，存在在基層不易 實施等缺點。
[0007] 2)普通PCR-RFLP方法技術簡便，價格便宜，適宜少量樣本的實驗室檢測，但RFLP 僅能檢測有酶切位點的突變，無酶切位點不能檢測，費時費力，還存在PCR產物污染導致 假陽性的風險，見[MolDiagnTher. 2010Jun1; 14(3): 163-9，UnitedStatesPatent 20120135406]。
[0008] 3)芯片技術與傳統的儀器檢測方法相比具有高通量、微型化、自動化等特點，適用 于全基因組突變掃描，不適宜單個基因的突變位點檢測，且精度低，價格昂貴。
[0009] 4)PCR高分辨熔解曲線分析技術，能高通量檢測基因的突變情況，試劑成本較低， 但因其熒光信號來自染料，特異性受到影響，而且檢測儀器是升級版的熒光PCR儀，價格高 昂，普及受限，見[ClinChimACqa. 2012Nov12;413(21-22):1781-5;UnitedStates Patent20110045479]〇
[0010] 5)PCR-TaqmanMGB探針法適合已知突變位點，常常需要兩條探針，而Taqman MGB探針的合成價格是普通Taqman探針的幾倍，見[JClinMicrobiol. 2010 Aug;48(8):2909-15;UnitedStatesPatent20090311679]，并且不能檢測樣本中的含量 較少（彡1，〇〇〇個中的1個）的等位基因或突變位點。
[0011] 6)PCR-SSCP法雖然簡單，但該法是開放性的檢測系統，容易造成PCR產物的污染， 而且操作步驟多，費時費力。
[0012] 7)等位基因特異性引物PCR擴增法（AS-PCR)，這一方法是目前檢測基因突變或 SNP最簡單快速的方法（WuDY,UgozzoliL,PalBK,WallaceRB.，ProcNatlAcad SciUSA1989; 86:2757-2760)，其原理是引物3'末端堿基與模板的堿基錯配，其PCR的 效率將會下降 1〇3-1〇6.6倍（Chen,X.，andSullivan,PF,ThePharmacogeonomics Journal2003，3，77-96)。盡管該方法的原理簡單，但錯配的引物，依然會發生非特異 性擴增，擴增情況視突變的類型和檢測位點周圍的堿基序列相關（AyyadevaraS,Thaden JJ,ShmooklerReisRJ.,AnalBiochem2000; 284:11-18)，還與樣本中存在的等位 基因變量的影響。為了增加AS-PCR的特異性，許多科學家做了很多努力。大量的實驗證 明，該方法最關鍵的是設計與3'末端突變位點堿基互補或錯配的兩條特異引物，引物設 計不好，將導致高背景的交叉擴增，會導致較高的假陽性。盡管不少人努力將這一弊端克 月艮，如報道的TaqMAMA方法，在3'倒數第二位或第三位上引入突變堿基，的確可以增加 反應的特異性，但仍然無法完全消除假陽性，而且在純合子與雜合子的判斷上，缺乏標準， 會出現混亂的情況，見[JVirolMethods. 2008Nov;153(2):156-62;Genomics. 2004 Feb;83 (2) :311-20]。簡單的AS-PCR，通常采用PCR反應結束后再進行電泳，從有無反應 條帶來判斷結果，這種方法雖然不需要昂貴的儀器，但電泳操作，增加了PCR的污染機會， 而且耗時費力。盡管有人對該方法作了改進，采用熒光定量PCR技術，但得到的不是"全或 無"式的結果，總會有非特異性反應的發生，即同樣的引物對野生型和突變型位點都會擴 增，只是其得到的Ct(Cyclethreshold)不同而已，因此就引入了ACt的概念，即ACt= 野生Ct-突變Ct，但計算復雜，如要ACt值大于純合子Ct值判為突變型純合子，ACt值 小于雜合子Ct值，判為雜合子，ACt值的引入不僅增加了操作步驟，還會引起混亂，因為 ACt值的設定標準無法準確定位，不同人員的操作、不同的標本和不同的檢測儀器都會有 不同的數字，給臨床應用帶來很大的困難，實際應用依然受限，見[中國專利CN101235415， CN101565742A]〇
[0013] 8)美國LIFE公司采用一種MGB封閉探針的方法，稱作Cast-PCR(Competitive allelespecificTaqmanPCR)，用MGB探針將不檢測的位點封閉，然后用等位基因特異 引物熒光定量PCR的方法檢測目的位點，這雖然提高了檢測的特異性，但由于多加入一 條MGB封閉探針，勢必增加成本，對反應效率多少會帶來干擾，見[ExpMolPathol. 2012 Jun; 92 (3): 275-80;UnitedStatesPatent20100221717 ;CN102428190A]。有人采用鎖 核酸（LNA) (PlantMethod2007, 3 :2)或修飾的堿基（AnalBiochem. 2005, 340 :287-294) 的PCR引物，可以使得AS-PCR檢測靈敏度提高。然而，這些方法增加了分析的總體成本，并 需對反應進行深度優化。
[0014] 國內廣州益善生物技術有限公司申請的一種TOGFRA基因突變檢測液相芯片（專 利號CN101984072A)，采用的液相芯片技術對TOGFRA基因的D842V突變情況進行檢測。
[0015] 芯片技術與傳統的儀器檢測方法相比具有高通量、微型化、自動化等特點，適用于 全基因組突變掃描，不適宜單個基因的突變位點檢測，且精度低，價格昂貴。而普通的熒光 定量PCR技術對最為關鍵的位點特異性引物設計，也僅按照引物設計的一般原則進行，沒 有一個好特異引物的篩選客觀指標，最為關鍵的是他們的結果判斷，依然模糊，沒有"全或 無"的概念，這樣非特異性的缺點還是無法克服。雙探針的熒光定量PCR方法，由于需要兩 條探針，而且常常是Taqma