一種用于ros1與多種基因發生融合突變的檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種用于R0S1與多種基因發生融合突變的 檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 肺癌是世界上癌癥死亡的主要原因，從組織病理學上可以分為小細胞肺癌 (SCLC)和非小細胞肺癌（non-smallcelllungcancer,NSCLC)兩大類，其中非小細胞肺癌 約占肺癌總病例的85 %。在我國肺癌患者5年生存率僅為13 %，而約70 %的NSCLC在確診 時己處于晚期。分化程度更低，轉移更快的小細胞肺癌（Smalllungcancer，SCLC)的治療 效果及生存率更不容樂觀。其主要原因是大多數肺癌由于缺乏高靈敏度的基因突變檢測和 確診技術，以及與之相配的科學治療方案，從而使患者錯失了治療的最佳時機。其主要治療 方法化療的療效并不讓人滿意。隨著腫瘤分子生物學的發展，肺癌的分子靶向治療因其特 異性高，毒副作用低，日益成為臨床醫生首選治療方式。R0S1融合在NSCLC病人中陽性率 為2-4%，并被公認為肺癌中致癌突變。R0S1基因為原癌基因，定位于第6號染色體，編碼 一個受體酪氨酸激酶。研宄發現，R0S1基因在乳頭狀甲狀腺癌和非小細胞肺癌中還可以和 CD74、EZR、LRIG3、SDC4、SLC3A42、TPM3、G0PC發生融合，其中R0S1同一點與在不同點斷裂 的CD74基因分別融合形成2種CD74-R0S1變異體；與不同斷裂點的SDC4融合形成2種不 同的SDC4-R0S1變異體；與不同斷裂點的SLC3A42形成2種不同的SLC3A42-R0S1變異體。 激活下游RAS/MAPK/ERK，PI3K/AKT，和phospholipaseCy號途徑，引起癌癥的發生（Gainor JF，ShawAT，The0ncologist2013 ;18 :865 - 875) 〇
[0003] 以克唑替尼為代表的藥物是針對R0S1基因融合突變開發的小分子靶向藥物，通 過抑制R0S1酪氨酸激酶區域的活性，阻斷其下游異常信號通路，從而抑制腫瘤細胞的生 長。臨床研宄表明克唑替尼對R0S1融合突變患者的有效率可達61%以上，而對野生型的 患者幾乎沒有療效。因此，檢測R0S1融合突變情況是指導克唑替尼類藥物用藥的前提和基 礎，在化療之前通過高敏度的檢測方法檢測R0S1融合基因突變對于提高患者的生存率，延 長生存期，避免過度化療，提高生存質量有著重要意義。因此檢測R0S1基因的融合狀態是 篩選克唑替尼適合患者的重要前提。
[0004] 目前，R0S1融合突變的檢測方法主要為熒光原位雜交（FISH)法，然而FISH法檢 測特異性差，靈敏度低，檢測時間長。此外，FISH檢測需要昂貴的專用儀器設備，試劑成本 較高，操作復雜，使臨床檢測廣泛使用受到了限制。FISH檢測要求檢測樣本保存時間不宜 過長，采用保存時間長的樣本進行檢測會導致假陰性的發生，影響了檢測的準確性。因此， FISH檢測法無法滿足臨床醫生檢測實際應用的需求，臨床迫切需要開發一種高靈敏度的可 以同時檢測R0S1融合基因多種突變的檢測方法，以實現采用快速的檢測方法對R0S1多種 融合突變進行同時檢測，從而為臨床肺癌個體化治療方案提供科學參考依據。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的：提供一種用于R0S1與多種基因發生融合突變的檢測試劑盒，可以 一次同時檢測R0S1基因的15種融合突變，檢測靈敏度高，檢測時間只需2小時即可完成， 同時具備了靈敏度高，特異性好，廉價快速，操作簡單等優點，可以滿足臨床快速檢測的實 際需求。
[0006] 為了實現上述目的，本發明的技術方案是：
[0007] -種用于R0S1與多種基因發生融合突變的檢測試劑盒，包括特異性反轉錄引物、 Q-PCR特異性引物和探針；
[0008] 所述的特異性反轉錄引物包括如下序列：
[0009]
【主權項】
1. 一種用于ROSl與多種基因發生融合突變的檢測試劑盒，其特征在于：包括特異性反 轉錄引物、Q-PCR特異性引物和探針； 所述的特異性反轉錄引物包括如下序列： ROS1 反轉泌 1: CCAGACAAAGGTCAGTGGGAT SEQ ID NO: 01 ROS1 反轉￥ 2: TCTTCAGCTTTCTCCCACTG SEQ ID NO： 02 ROS1 反轉錄 3: GCCAACTCTTTGTCTTCGTTT SEQ ID NO： 03 ROS1 反轉氽 4: CACTTCTCCAAAGGCTCCAC SEQ ID NO： 04 Actin 反轉泌 5: CAGGAGGAGCAATGATCTTG SEQ ID NO： 05； 所述的Q-PCR特異性引物和探針核苷酸序列包括： Mix I :CD47 ;SDC4 ;SLC34A2和ROSl基因融合，其序列如下： CD47-E6 TGAGCAGGCACTCCTTGGAG SEQ ID NO： 06 SDC4-E2 AGCTGTCTGGCTCTGGAGAT SEQ ID NO： 07 SDC4-E4 TTGAGAGAACGGAGGTCCTG SEQ ID N0.0 8 SLC34A2-E4 TCTTAGTAGCGCCTTCCAGC SEQ ID NO： 09 SLC34A2-E13 AAGGCTCCTGAGACCTTTGAT SEQ ID NO： 10 ROS1-E32R TCTTCAGCTTTCTCCCACTG SEQ ID NO： 11 Taqman ROS1-E32 FAM-5- CAGGCATTCCCAAATTAC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO： 12； Mix 2 :CD47 ;EZR ;SDC4 ;SLC34A2 和 ROS 基因融合，其序列如下： CD47-E6 TGAGCAGGCACTCCTTGGAG SEQ ID NO： 13 EZR-E10 GGCTGCAGGACTATGAGGAG SEQ ID NO： 14 SDC4-E2 AGCTGTCTGGCTCTGGAGAT SEQ ID NO： 15 SDC4-E4 TTGAGAGAACGGAGGTCCTG SEQ ID NO： 16 SLC34A2-E4 TCTTAGTAGCGCCTTCCAGC SEQ ID NO： 17 SLC34A2-E13 AAG G CTC CTG AG AC CTTTG AT SEQ ID NO： 18 ROS1-E34R CCAGACAAAGGTCAGTGGGAT SEQ ID NO： 19 TaqmanROSI-E34 FAM-5-TTGGAATATTTCTGGTTGTTAC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO： 20； Mix 3 :LRIG3 ;TPM3 ;G0PC和ROSl基因融合，其序列如下： LRIG3-E16 TCACATCTTCAGGTGCTGGAT SEQ ID NO： 21 TPM3-E8 GCCAAGCTGGAAAAGACAAT SEQ ID NO： 22 GOPC-E8 GCAAAGACACAAGTGGGGAA SEQ ID NO. 23 ROS-E35R AAGGGGTGACAGTGCTT SEQ ID NO· 24 Taqman ROS1-E35 FAM-5-GCCAACTCTTTGTCTTCGTTT-3-BHQ-MGB SEQ ID NO： 25； Mix 4 :G0PC和RO