一種水稻穗頸長度基因qPNL-12的分子標記的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于水稻遺傳改良與農業生物技術應用領域，涉及一種水稻穗頸長度基因 qPNL-12的分子標記，尤其涉及與qPNL-12基因緊密連鎖分子標記的核苷酸序列及用于擴 增分子標記的正、反向特異引物。
【背景技術】
[0002] 穗頸長度又稱為穗抽出度，指劍葉葉鞘到穗基部的距離，它作為連接莖桿和穗的 一個重要農藝性狀，在營養物質和水分從莖桿和葉片到穗部的運輸過程中發揮著極其關鍵 的作用。目前生產上所用的大多數水稻不育系具有不同程度的包穗特征（由穗抽出度過 短導致），大大影響了雜交稻制種產量的提高。二十世紀八十年代，水稻長穗頸基因eui的 發現被認為是三系雜交水稻種子生產中繼不育系、保持系和恢復系后的第四要素。導入 eui基因的不育系從遺傳水平上緩解了其包穗現象，提高了其對外源GA3的敏感性（Rutger JN，etal.，CropSci，1981，21:373-376)。然而，單基因的使用并不能完全解除不育系 的包穗問題（梁康逕等，福建農學院學報，1992, 21:380-385;何祖華等，中國水稻科 學，1991，5:1-6)。楊仁崔等（中國工程科學，2005,7(8):26-30)利用攜帶 61111基因的協青 早eA不育系育成的雜交稻在生產上卻出現生長過快、植株偏高和葉面積較大等不良性狀。 因此，挖掘更多有用的穗頸長度基因對更好地改良雜交稻不育系或恢復系的穗頸長度具有 重要意義，也可為研宄穗頸伸長的遺傳機制奠定基礎。
[0003] 迄今為止，有多個穗頸長度相關基因已經被克隆或精細定位。EUI1和EUI2 為兩個已克隆的控制水稻穗頸伸長的基因，EUI1基因編碼一個細胞色素P450單加氧 酶（LuoA，etal.，PlantCellPhysiol, 2006, 47:181-191;ZhuYY，etal.，Plant Cell, 2006, 18:442-456)，位于水稻第5染色體上。EUI2基因編碼一個環氧化物酶的同 源蛋白，位于水稻第10染色體上（朱宏波，福建農林大學博士論文，2003 ;黃偉素，浙江 大學碩士論文，2006)。EUI1和EUI2基因在水稻內源赤霉素合成途徑中起負調控功能， 功能缺失后會造成赤霉素在最上節間大量積累，從而使水稻穗頸極具伸長。目前僅有1 個短穗頸或包穗基因SUI1被克隆。SUI1位于水稻第1染色體上，編碼一個磷脂酰絲氨 酸合成酶，通過調節倒一節的細胞長度來調控水稻穗頸長度（ZhuL，etal.，PlantMol Biol，2011，77:475-487)，該基因突變后導致包穗特征，并引起突變體的谷粒產量明顯下 降。已經精細定位或初步定位的短穗頸基因的研宄則相對較多，ESP2、SHP6、SUI4分別被 精細定位于水稻第1、2和7染色體上（朱克明，揚州大學碩士論文，2006 ;官華忠等，科 學通報，2011，56:741-745;JiH，etal.，PlantBiotechnolR印，2014, 8:125-134)，SHP1， SHP3,SHP4和SHP5分別被初定位于水稻第1，5,3和4染色體上（劉莊等，中國農學通 報，2006, 22 (12) : 409-412 ;王偉平等，中國農學通報，2008, 24 (6) : 212-216)。基于以上表 述，尚未有關于水稻穗頸長度相關基因定位于第12條染色體上的報道。
[0004] 申請工作人員前期以秈稻品種9311為受體親本、粳稻品種日本晴為供體親本經 過雜交、多代回交和自交，構建了一套高代回交置換系群體，并建立了高密度物理圖譜（趙 春芳等，植物學報，2012, 47:594-601)，為農藝性狀的QTL定位奠定了基礎。隨后，申請工 作人員對置換系群體中穗頸長度性狀進行調查，鑒定出一個極短穗頸表型的置換系C115， 與受體親本9311的穗頸長度具有極顯著差異（P〈0. 01)。以C115和9311為親本，構建了 F2分離群體，利用遺傳分析和基因連鎖分析，初步定位了C115短穗頸表型的控制基因，將 其定位于水稻第12染色體的兩個SSR標記RM7102和RM277之間，兩標記間的物理距離為 5. 10Mb，命名為qPNL_12(趙春芳等，植物學報，2015)。經與已克隆的穗頸長度相關基因 比較，該基因為一個新的穗頸長度基因。在此基礎上，本發明進一步尋找更加逼近目標基因 qPNL-12的分子標記，實現對qPNL-12基因的精細定位，篩選到了比通用SSR標記更緊密連 鎖甚至共分離的分子標記。這些緊密連鎖標記將為qPNL-12基因的克隆奠定基礎，同時為 水稻育種中穗頸長度的標記輔助選擇提供更有效的分子標記。
【發明內容】
[0005] 本發明針對目前雜交稻生產上利用的穗頸長度基因過于單一，而且En基因的使 用還帶來了不利效應，因此本發明提供了一種水稻穗頸長度基因qPNL-12的分子標記。
[0006] 本發明具體通過以下技術方案實現：
[0007] 本發明以水稻為物種，通過對qPNL-12初定位區間內秈粳稻的基因組序列差異性 比較，在堿基插入/缺失處設計InDel分子標記，確定了Indl529和Indl561是與qPNL-12 基因連鎖最緊密的兩個分子標記，并克隆測序了這兩個標記的核甘酸序列，其中分子標記 Indl529的核苷酸序列為SEQIDNO. 1 ;分子標記Indl561的核苷酸序列為SEQIDNO. 2。
[0008] 基于上述發現，本發明提供了一種水稻穗頸長度基因qPNL-12的分子標記，分為 上游分子標記Indl529和下游分子標記Indl561，其中分子標記Indl529和Indl561分別基 于核苷酸序列如SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示的特異性插入/缺失位點多態。
[0009] 所述的水稻穗頸長度基因qPNL-12分子標記的引物組合物，用于擴增分子標記 Indl529的特異性正反向引物分別如SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4所示，用于擴增分子標記 Indl561的特異性正反向引物分別如SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6所示。
[0010] 本發明分子標記的核苷酸序列還包括在SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2序列中添加、 取代、插入和缺失一個或多個核苷酸生成的衍生序列。
[0011] 本發明還提供了所述的分子標記的引物組合物用于水稻穗頸長度新基因qPNL-12 的精細定位或克隆的應用，還用于含qPNL-12基因的水稻材料穗頸長度性狀的標記輔助選 擇育種的應用。
[0012] 本發明的有益效果為：
[0013] 1)本發明方法中的分子標記進一步定位了水稻穗頸長度新基因qPNL-12。標記的 特異性強、穩定性高，并且標記的使用方法簡便快捷，不涉及DNA測序、限制性內切酶等的 使用，不存在費時費力、價格昂貴等弊端。
[0014] 2)本發明方法中的分子標記均為擴增短片段的PCR標記，具有試驗試劑用量少、 速度快、成本低、高通量等優點，并且對DNA模板質量和檢測設備要求不高，非常適合現代 農業中的分子育種趨勢。
[0015] 3)本發明方法中的分子標記是共顯性標記，可以實現分離群體中短穗頸單株、長 穗頸單株以及雜合單株的同時鑒定。
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