一種重編程獲得功能性人肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種重編程獲得功能性人肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝臟是人體新陳代謝的重要器官，也是最重要的解毒器官。肝臟中執(zhí)行肝臟功能 的最主要細(xì)胞類型是肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞。肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的主要關(guān)鍵功能包括：藥物代謝、清潔和 解毒血液中的毒素和廢物、合成和存儲(chǔ)機(jī)體所需的糖類、蛋白、脂肪和其他物質(zhì)等。由于肝 臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞執(zhí)行了大多數(shù)肝臟的關(guān)鍵功能，因此獲得具有功能的人肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞具有非常 重要的應(yīng)用價(jià)值，尤其是在藥物研發(fā)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
[0003] 肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞可以在藥物研發(fā)中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。目前導(dǎo)致候選藥物失敗的主要 原因是其ADME(吸收、分布、代謝、排泄）方面不理想。由于肝臟在藥物的代謝活動(dòng)中發(fā)揮 核心作用，因此在所有新藥研發(fā)過(guò)程中，一個(gè)必須的研究環(huán)節(jié)是檢測(cè)藥物在肝細(xì)胞的代謝 情況和毒理效應(yīng)，人肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞具有完整的參與藥物代謝的三相代謝酶，以及完備的調(diào) 控藥物代謝的輔因子，因此使用人肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞在體外進(jìn)行藥物代謝的研究結(jié)果可以很好 地反應(yīng)藥物在體內(nèi)的代謝情況。目前在體外藥物研發(fā)上主要使用的是人成體原代肝細(xì)胞， 由于來(lái)源及其有限，并且原代肝細(xì)胞的功能很難在體外維持，因此其在藥物研發(fā)上的應(yīng)用 相當(dāng)受限。
[0004] 在治療肝功能衰竭和喪失的疾病上，肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞也有重要的應(yīng)用前景，特別是 在生物人工肝支持系統(tǒng)方面。肝功能的衰竭和喪失是最為嚴(yán)重的肝臟疾病之一，以急性肝 功能衰竭為例，其起病急、病程發(fā)展快，原位肝移植是目前治療此類疾病的主要手段，但是 由于供體的嚴(yán)重缺乏，許多病人在等待肝移植的過(guò)程中死亡。基于肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建的生 物人工肝支持系統(tǒng)可暫時(shí)替代衰竭肝臟的主要功能，清除有害物質(zhì)，補(bǔ)充肝臟合成的生物 活性物質(zhì)，穩(wěn)定和改善病人的內(nèi)環(huán)境，直到有合適的供體來(lái)源用于移植。此外，由于肝臟具 有強(qiáng)大的再生能力，在生物人工肝支持系統(tǒng)的幫助下有可能使肝細(xì)胞再生，直至自身的肝 臟功能恢復(fù)。目前研發(fā)中的生物人工肝支持系統(tǒng)多采用豬肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞以及人肝臟實(shí)質(zhì)細(xì) 胞系，這些細(xì)胞來(lái)源存在一些關(guān)鍵問(wèn)題制約了其應(yīng)用，如物種差異可能導(dǎo)致的免疫排斥反 應(yīng)、肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞體外功能水平低下、肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞缺乏增殖能力等。
[0005] 此外，人肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞還可用于構(gòu)建人源化肝臟小鼠模型，該模型可以解決乙型 肝炎病毒（HBV)，丙型肝炎病毒（HCV)和瘧疾（Malaria)等人類傳染病缺乏動(dòng)物感染模型的 難題，為這些疾病的病理研究、疫苗和新藥研發(fā)以及人肝細(xì)胞代謝功能的體內(nèi)研究提供可 靠的研究平臺(tái)。
[0006] 人肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞雖然具有廣闊的應(yīng)用前景，但是如何在體外獲得大量的功能性人 肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞是制約其應(yīng)用的瓶頸因素。如前所述，現(xiàn)有的人肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞來(lái)源，如人成體 原代肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞、人肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞系等，來(lái)源困難，數(shù)量及其有限，因此很難同時(shí)解決維 持肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的功能水平和獲得較強(qiáng)的體外擴(kuò)增能力兩大問(wèn)題。通過(guò)干細(xì)胞分化等方法 獲得的肝臟細(xì)胞，其代謝功能不完善。因此，需要開(kāi)發(fā)新的策略和方法來(lái)解決這一難題。
[0007] 細(xì)胞重編程技術(shù)能夠通過(guò)特定方法在體細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子蛋白來(lái)調(diào)控細(xì)胞 命運(yùn)，使其轉(zhuǎn)變?yōu)樘囟愋偷墓δ芗?xì)胞。目前已經(jīng)有報(bào)道在鼠成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)肝臟特 定的轉(zhuǎn)錄因子能夠使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為鼠肝細(xì)胞。但是，這些重編程來(lái)源的鼠肝細(xì)胞功 能并不成熟，例如表達(dá)AFP，并且其藥物代謝最關(guān)鍵的P450酶活性較低。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供誘導(dǎo)因子HNF1A、HNF6、HNF4A、ATF5、PR0X1、CEBPA、MYC 和p53基因抑制劑的至少一種的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明提供的誘導(dǎo)因子HNF1A、HNF6、HNF4A、ATF5、PR0X1、CEBPA、MYC和p53 基因 抑制劑的至少一種在用于誘導(dǎo)產(chǎn)生人工體外來(lái)源的，具有肝臟代謝功能的哺乳動(dòng)物肝臟實(shí) 質(zhì)細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0010] 上述應(yīng)用中，所述誘導(dǎo)因子為DNA形式，mRNA形式或蛋白質(zhì)形式；
[0011] 所述哺乳動(dòng)物具體為人、大鼠、小鼠、猴、狗、貓、牛、兔、馬或豬；所述哺乳動(dòng)物尤其 具體為人。
[0012] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用重編程體外制備人工體外來(lái)源的，具有肝臟代 謝功能的哺乳動(dòng)物肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的方法。
[0013] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：
[0014] (1)使離體哺乳動(dòng)物體細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或表達(dá)誘導(dǎo)因子HNF1A、HNF6、HNF4A、ATF5、 PR0X1、CEBPA、MYC中的至少一種，且抑制所述離體哺乳動(dòng)物體細(xì)胞中p53基因、p53mRNA或 P53蛋白的表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，
[0015] (2)在肝細(xì)胞培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，即得到人工體外來(lái)源的，具有肝 臟代謝功能的肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
[0016] 上述方法中，
[0017]所述步驟（1)的方法如下：將誘導(dǎo)因子導(dǎo)入離體哺乳動(dòng)物體細(xì)胞中，培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn) 基因細(xì)胞，
[0018] 所述誘導(dǎo)因子為HNF1A基因、HNF6基因、HNF4A基因、ATF5基因、PR0X1基因、CEPBA 基因、MYC基因和抑制p53基因表達(dá)的DNA分子中的至少一種。
[0019] 上述方法中，所述誘導(dǎo)因子為如下1)或2):
[0020] 1)所述誘導(dǎo)因子為HNF1A基因、HNF6基因、HNF4A基因、ATF5基因、PR0X1基因、 CEPBA基因、MYC基因和抑制p53基因表達(dá)的DNA分子；
[0021] 2)所述誘導(dǎo)因子為HNF1A基因、HNF6基因、HNF4A基因、ATF5基因、PR0X1基因、 CEPBA基因、MYC基因和抑制p53基因表達(dá)的DNA分子中任意三個(gè)。
[0022] 上述方法中，所述體細(xì)胞為成纖維細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、胃細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞或血液細(xì) 胞；
[0023] 所述哺乳動(dòng)物具體為人、大鼠、小鼠、猴、狗、貓、牛、兔、馬或豬；所述哺乳動(dòng)物尤其 具體為人。
[0024] 上述方法中，各種所述誘導(dǎo)因子均通過(guò)表達(dá)其的慢病毒共同導(dǎo)入所述哺乳動(dòng)物體 細(xì)胞中；
[0025] 各種所述誘導(dǎo)因子及其對(duì)應(yīng)的慢病毒如下：
[0026] 所述HNF1A基因，其對(duì)應(yīng)的慢病毒為表達(dá)HNF1A的慢病毒；
[0027] 所述HNF6基因，其對(duì)應(yīng)的慢病毒為表達(dá)HNF6的慢病毒；
[0028] 所述HNF4A基因，其對(duì)應(yīng)的慢病毒為表達(dá)HNF4A的慢病毒；
[0029] 所述ATF5基因，其對(duì)應(yīng)的慢病毒為表達(dá)ATF5的慢病毒；
[0030] 所述PR0X1基因，其對(duì)應(yīng)的慢病毒為表達(dá)PR0X1的慢病毒；
[0031] 所述CEBPA基因，其對(duì)應(yīng)的慢病毒為表達(dá)CEBPA的慢病毒；
[0032] 所述MYC基因，其對(duì)應(yīng)的慢病毒為表達(dá)MYC的慢病毒；
[0033] 所述抑制p53基因表達(dá)的DNA分子，其對(duì)應(yīng)的慢病毒為抑制p53基因表達(dá)的慢病 毒。
[0034] 上述方法中，所述HNF1A基因的核苷酸序列為序列表中的序列1;
[0035] 所述HNF6基因的核苷酸序列為序列表中的序列2;
[0036] 所述HNF4A基因的核苷酸序列為序列表中的序列3;
[0037]所述ATF5基因的核苷酸序列為序列表中的序列4;
[0038] 所述PR0X1基因的核苷酸序列為序列表中的序列5 ;
[0039] 所述CEBPA基因的核苷酸序列為序列表中的序列6;
[0040]所述MYC基因的核苷酸序列為序列表中的序列7 ;
[0041] 所述抑制p53基因表達(dá)的DNA分子由序列表中序列8所不的單鏈DNA分子和序列 表中序列9所示的單鏈DNA分子退火得到；
[0042]步驟1)中，所述培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為哺乳動(dòng)物體細(xì)胞培養(yǎng)基；
[0043] 所述培養(yǎng)的時(shí)間為以慢病毒感染哺乳動(dòng)物體細(xì)胞起5-14天；
[0044] 步驟2)中，所述繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間為以慢病毒感染哺乳動(dòng)物體細(xì)胞起15-35天。
[0045] 所述表達(dá)各種誘導(dǎo)因子的慢病毒等量共同導(dǎo)入所述哺乳動(dòng)物體細(xì)胞中；
[0046] 所述表達(dá)HNF1A基因的慢病毒為由表達(dá)HNF1A基因的重組載體導(dǎo)入靶細(xì)胞中，包 裝得到；
[0047] 所述表達(dá)HNF6基因的慢病毒為由表達(dá)HNF6基因的重組載體導(dǎo)入靶細(xì)胞中，包裝 得到；
[0048] 所述表達(dá)HNF4A的慢病毒為由表達(dá)HNF4A基因的重組載體導(dǎo)入靶細(xì)胞中，包裝得 到；
[0049] 所述表達(dá)ATF5的慢病毒為由表達(dá)ATF5基因的重組載體導(dǎo)入靶細(xì)胞中，包裝得 到；
[0050] 所述表達(dá)PR0X1的慢病毒為由表達(dá)PR0X1基因的重組載體導(dǎo)入靶細(xì)胞中，包裝得 到；
[0051] 所述表達(dá)CEBPA的慢病毒為由表達(dá)CEBPA基因的重組載體導(dǎo)入靶細(xì)胞中，包裝得 到；
[0052] 所述表達(dá)MYC的慢病毒為由表達(dá)MYC基因的重組載體導(dǎo)入靶細(xì)胞中，包裝得到；
[0053] 所述抑制p53基因表達(dá)的慢病毒為由抑制p53基因表達(dá)的重組載體導(dǎo)入靶細(xì)胞 中，包裝得到。
[0054] 所述表達(dá)HNF1A基因的重組載體A為將HNF1A基因插入p⑶H-EFl-MCS-T2A-Puro 表達(dá)載體得到的重組載體；
[0055] 所述表達(dá)HNF6基基因的重組載體B為將HNF6基因插入pCDH-EFl-MCS-T2A-Puro 表達(dá)載體得到的重組載體；
[0056] 所述表達(dá)HNF4A基因的重組載體C為將HNF4A基因插入p⑶H-EFl-MCS-T2A-Puro 表達(dá)載體得到的重組載體；
[0057] 所述表達(dá)ATF5基因的重組載體D為將ATF5基因插入p⑶H-EFl-MCS-T2A-Puro表 達(dá)載體得到的重組載體；
[0058] 所述表達(dá)PR0X1基因的重組載體E為將PR0X1基因插入pCDH-EFl-MCS-T2A-Puro 表達(dá)載體得到的重組載體；
[0059] 所述表達(dá)CEBPA基因的重組載體F為將CEPBA基因插入pCDH-EFl-MCS-T2A-Puro 表達(dá)載體得到的重組載體；
[0060] 所述表達(dá)MYC基因的重組載體G為將MYC基因插入pll3. 7表達(dá)載體得到的重組 載體；
[0061] 所述抑制p53基因表達(dá)的重組載體H為將抑制p53基因的DNA分子插入pll3. 7 表達(dá)載體得到的重組載體。
[0062] 由上述方法得到的哺乳動(dòng)物肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；
[0063] 或通過(guò)轉(zhuǎn)基因或添加誘導(dǎo)因子的方法誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞肝臟特異基因的表達(dá)而 產(chǎn)生人工體外來(lái)源的，具有肝臟代謝功能的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；
[0064] 所述哺乳動(dòng)物具體為人、大鼠、小鼠、猴、狗、貓、牛、兔、馬或豬；所述哺乳動(dòng)物尤其 具體為人。
[0065] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于誘導(dǎo)產(chǎn)生具有肝臟代謝功能的哺乳動(dòng)物肝 臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的試劑盒。
[0066] 本發(fā)明提供的試劑盒，為如下1) _3)中任一種：