一種抑制核酸擴增產物污染的方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種抑制核酸擴增產物污染的方法及應用，屬于基因工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 現如今在食品質量安全檢測、臨床醫學以及法醫鑒定中，對于致病菌、目標DNA的 檢測大多用核酸擴增的方法，主要為PCR、熒光定量PCR和環介導等溫擴增（LAMP)等方法。 而在檢測過程中，各檢測實驗室常被核酸擴增產物的污染所困擾，由于核酸污染所導致的 假陽性結果會造成檢測的失敗。然而，到如今對于這種污染的預防多數都在于實驗室對環 境和設施的嚴格分區管理和定期的清潔制度。一旦發生了核酸的污染，采取的措施就是對 污染區域用次氯酸鈉進行徹底的清潔、2周之內不要做任何的擴增實驗或更換實驗地點，使 DNA進行自身的降解以達到消除核酸擴增產物造成的污染。這些就是現階段對于消除核酸 擴增產物污染的有效手段。但是，所需要消耗的費用、人員和時間都很多，不利于檢測工作 的進行，并造成了較大的時間和經濟損失。
[0003] 疊氮溴化丙錠（PMA)是biotium公司開發的一種具有高親和力的光敏DNA綁定染 料。染料本身具有弱熒光的，但是和核酸結合之后熒光性變強。它具有高親和性并優先結 合到雙鏈DNA上。由于光解作用，染料上光敏的疊氮基轉化為高反應性的氮烯基，其易于與 結合部位的任何烴（碳氫化合物）部分反應，形成穩定的共價鍵的氮-碳鍵，從而導致永久 性的DNA修飾。染料幾乎完全細胞膜不透性，從而可以用于有選擇地修飾只從死細胞中暴 露出來的DNA，而遠離活細胞中完整的DNA。目前，對PMA的應用主要是去除死菌對檢測結 果的影響，還沒有利用PMA進行抑制核酸擴增產物污染的報道。
【發明內容】
[0004] 為解決上述問題，本發明提供了一種抑制核酸擴增產物污染的方法，所采取的技 術方案如下：
[0005] 本發明的目的在于提供一種抑制核酸擴增產物污染的方法，該方法是利用疊氮溴 化丙錠溶液處理污染有核酸擴增產物的環境，再對環境進行曝光處理。
[0006] 所述方法的步驟如下：
[0007] 1)利用二甲基亞砜（DMS0)或水溶解疊氮溴化丙錠，配制疊氮溴化丙錠溶液； [0008] 2)將步驟1)所得的疊氮溴化丙錠溶液溶解、噴灑或涂抹到污染環境中；
[0009] 3)對步驟2)經過處理的環境進行曝光處理。
[0010] 優選地，步驟1)所述配制疊氮溴化丙錠溶液，是利用二甲基亞砜或水溶解疊氮溴 化丙錠至濃度2mM以上。
[0011] 優選地，步驟2)所述將疊氮溴化丙錠溶液溶解噴涂污染環境中，抑制PCR產物時， 疊氮溴化丙錠溶液工作時的濃度在〇. 〇3mM以上。
[0012] 優選地，步驟2)所述將疊氮溴化丙錠溶液溶解噴涂污染環境中，抑制LAMP產物 時，疊氮溴化丙錠溶液工作時的濃度在〇. 148mM以上。
[0013] 優選地，步驟3)所述曝光處理，是在光強11151ux-1115001ux下，處理0.5-30min。
[0014] 更優選地，所述曝光處理，是在光強1115001ux下處理30s。
[0015] 更優選地，所述曝光處理，是在光強11151ux下處理30min。
[0016] 所述方法的具體步驟如下：
[0017] 1)利用二甲基亞砜溶解疊氮溴化丙錠至濃度為2mM，獲得疊氮溴化丙錠溶液；
[0018] 2)將步驟1)所得的疊氮溴化丙錠溶液溶解、噴灑或涂抹到污染環境中，其中，在 抑制PCR產物時，疊氮溴化丙錠溶液工作時的濃度在0. 03mM以上，在抑制LAMP產物時，疊 氮溴化丙錠溶液工作時的濃度在0. 148mM以上；
[0019] 3)在光強1115001ux下處理30s。
[0020] 所述方法用于預防和消除實驗室或工廠中的核酸擴增產物的污染。
[0021] 優選地，所述方法，的具體步驟如下：
[0022] 1)利用二甲基亞砜溶解疊氮溴化丙錠至濃度為2mM，獲得疊氮溴化丙錠溶液；
[0023] 2)將步驟1)所得的疊氮溴化丙錠溶液溶解、噴灑或涂抹到污染環境中；
[0024] 3)在光強1115001ux下處理30s;
[0025] 4)處理結束后，利用無污染的水清洗或噴涂污染環境后，在光強1115001UX的條 件下處理30min，以消除殘留PMA對日后實驗可能的影響。
[0026] 本發明的原理在于，由于PMA結構中帶有一個疊氮基團（_N3)，在光激發下脫去 (_N2)形成活躍的氮賓中間體，能與DNA形成永久性的共價鍵（-NH-CH，)，使DNA不能發生 擴增反應。
[0027] 本發明所取得的有益效果如下：
[0028] 1.本發明所提供的方法可以有效的抑制PCR、實時熒光定量PCR(resl-time PCR)、反轉錄PCR(RT-PCR)、核酸序列依賴性擴增技術（NASBA)、鏈置換擴增（SDA)技術和環 介導等溫擴增（LAMP)技術等核酸擴增方法中所產生的污染，解決了陽性核酸擴增產物對 日后核酸擴增實驗的干擾問題，能夠很好的抑制核酸擴增過程中，假陽性結果的出現。
[0029] 2.本發明所提供的方法，操作步驟十分簡單方便，耗時也很短。本發明所提供的方 法省略了現有技術在黑暗中孵育的步驟，也可以獲得良好的技術效果。同時，利用本發明所 提供的方法處理過的環境，處理結束后立即就可進行擴增實驗，無需等待污染源自身降解， 大大縮短了處理時間。
[0030] 3.在本專利之前，疊氮溴化丙錠主要是對活菌和死菌進行區分，細菌的DNA常為 低卷曲的負性超螺旋結構。現有技術僅能說明疊氮溴化丙錠可以與這種低卷曲的負性超螺 旋結構DNA進行結合，并產生抑制作用，卻尚無研宄證明疊氮溴化丙錠對經過LAMP擴增以 后形成的具有不同個數莖環結構和多環菜花樣結構的DNA也可以起到抑制作用。本發明所 提供的方法實現了對環介導等溫擴增（LAMP)技術所產生的特殊的莖環狀結構擴增產物的 抑制，能夠避免污染LAMP擴增產物所引起的假陽性結果。
【附圖說明】
[0031] 圖1為實施例2中PMA對LAMP產物的污染的抑制效果；
[0032](M:Marker;1:陽性；2-7:暗孵育時間分別為Omin;lmin;2min;3min;4min; 5min;8 :陰性）。
[0033] 圖2為實施例3中不同光源的燈光對核酸產物抑制效果的影響；
[0034](M:Marker; 1 :陽性；2 :光照強度為1115lux的白熾燈光照；3 :光照強度為 11151UX的鹵素燈光照；4 :陰性）。
[0035] 圖3為實施例4中DMSO對于LAMP產物污染抑制效果的影響；
[0036](M :Marker;1 :2ul2mMPMA處理LAMP產物；2 :2ulDMSO處理LAMP產物；3 :陽 性）。
[0037] 圖4為實施例5中PMA對LAMP產物的抑制效果；
[0038](M:MarkerD2000 ;1:陽性