一種胰腺炎型鴨1型甲肝病毒弱毒疫苗株a75及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉生物疫苗研發領域，具體為一種胰腺炎型鴨1型甲肝病毒弱毒疫苗株 A75及其應用。
【背景技術】
[0002] 鴨甲肝病毒（duckhepatitisAvirus,DHAV)是引起雛鴨病毒性肝炎的病原，屬 小RNA病毒科禽肝病毒屬成員。
[0003] 鴨甲肝病毒可分為DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3三種基因型。
[0004]自1999年以來，我國鴨群流行的鴨肝炎病毒除主要的DHAV-1外，DHAV-3日漸 增多，且兩者主要侵害3周齡內的雛鴨，其中以北京雛鴨、櫻桃谷雛鴨最易感，發病率高達 70%、病死率高達60%，病死鴨主要臨床特征多呈角弓反張和肝臟腫大、出血，這些特征為臨 床快速診斷該病的重要依據。
[0005]然而2011年9月，我國浙江省金華等地區和福建省莆田等地區7~30日齡雛番鴨 發生以胰腺發黃(暫稱為胰腺炎)為特征的疫病，發病率20%~30%、病死率25%~40%。至今，浙 江、福建、廣東、廣西等六省（市、自治區）的雛番鴨和雛半番鴨均有發生此病，對我國養鴨業 構成了較大危害。
[0006] 我們經過大量試驗研宄確定其病原為鴨1型甲肝病毒，但所致特征病變卻為胰 腺發黃、胰腺上皮細胞嚴重變性和壞死，完全不同于引起典型肝炎的DHAV-1 (稱為肝炎型DHAV-1)所致的肝臟嚴重出血、肝細胞嚴重變性和壞死的特征病變。
[0007] 為區別起見，將新流行的致胰腺發黃的鴨1型甲肝病毒暫定名為胰腺炎型鴨1型 甲肝病毒(胰腺炎型鴨1型甲肝病毒)。
[0008] 經過與肝炎型鴨1型甲肝病毒血清發生交叉中和試驗，確定其為鴨1型甲肝病毒 亞型。
[0009] 由于使用現有的鴨1型甲肝病毒疫苗對其預防效果不理想，亞型的出現給DHAV-1 的預防帶來了新的挑戰，因此對于胰腺炎型鴨1型甲肝病毒疫苗的研發刻不容緩。
[0010] 疫苗免疫是預防畜禽病毒病的首選。
[0011] 由于我國中養鴨生產大國，其飼養量占全球總量的75%以上，胰腺炎型鴨1型甲肝 病毒發生地域廣、危害大，因此獲得適于研制活疫苗用的胰腺炎型鴨1型甲肝病毒的致弱 毒株對其疫苗的研發至關重要。
[0012] 目前尚未見胰腺炎型鴨1型甲肝病毒弱毒株的相關報道。
【發明內容】
[0013] 本發明要解決的技術問題是克服現有的缺陷，提供一種胰腺炎型鴨1型甲肝病毒 弱毒疫苗株A75。
[0014] 本發明將4株新分離鑒定的胰腺炎型鴨1型甲肝病毒MPZJ1206毒株經過在鴨胚 傳代適應后，又在鴨胚成纖維細胞上進行連續傳代，經過多代細胞連續培養致弱了胰腺炎 型鴨1型甲肝病毒，并獲得了 1株對雛鴨無致病力、免疫原性良好、適于細胞大量增殖、符合 制備活疫苗用的候選弱毒株A75,其特征在于，該毒株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNO. 10492 ;用該弱毒株A75制備出的弱毒活疫苗應 用于雛鴨，具有良好的免疫預防作用，免疫雛番鴨保護率96. 7%以上。
[0015] 該胰腺炎型鴨1型甲肝病毒弱毒疫苗株A75,的制備方法包括以下步驟制備： 1)、在未感染疾病的11日齡番鴨胚上將胰腺炎型鴨1型甲肝病毒MPZJ1206連續傳30 代嗎，收集第30代的病毒尿囊液作為在細胞上培養的病毒液；每代接3枚胚，并觀察和紀錄 每一代番鴨胚胚體病變情況、死亡時間和死亡率； 結果：MPZJ1206毒株盲傳到第17代至第30代，100%的番鴨胚于接種后72h~96h死亡。 剖檢鴨胚的病變為胚頭、頸部、胸部、翅膀及爪部均有出血。
[0016] 2)、將第30代的番鴨胚尿囊液在鴨胚成纖維細胞上，接種量為鴨胚成纖維細胞體 積的1/10,培養60分鐘后，補加含有1%體積濃度的小牛血清和抗生素（2000IU青霉素和 2000yg/mL鏈霉素）的培養基維持液進行病毒增殖；連續傳代到50~80代；測定每代的 TCID5(I和致病性，對無致病性的傳代毒進行免疫原性和穩定性測定，直至獲得符合制備弱毒 活疫苗用的候選毒種； 3)、當細胞病變達到80%時，將T25細胞培養瓶置于-80°C冰箱凍存，結凍后取出細胞 瓶放室溫解凍，凍融兩次后，于生物安全柜里用移液管用力吹打細胞，將病毒懸液移至離 心管，以l〇〇〇〇rpm離心15分鐘，收集離心后的上清液，獲得含胰腺炎型鴨1型甲肝病毒 MPZJ1206弱毒疫苗株的液體，待用于后續的病毒滴度測定和弱毒疫苗制備。
[0017] 進一步的，鴨胚成纖維細胞的制作方法 1) 、取11日未感染疾病的齡番鴨胚(無胰腺炎型DHAV-1母源抗體)，消毒； 2) 、在無菌的生物安全柜內，用高壓滅菌的鑷子取出1)中的鴨胚，放于含PBS緩沖液的 平皿內，洗滌兩次后，剪掉鴨胚的頭部、頸部、四肢及內臟，將剩余的胚體部分剪碎接著用體 積濃度為〇. 25%的胰蛋白酶消化，再用移液管吹打細胞成單個的鴨胚成纖維細胞，用體積 濃度為6%為小牛血清稀釋成105/mL的細胞密度后，移至T25細胞培養瓶內，于37°C，5%C02 的細胞培養箱培養過夜，，次日用于接種胰腺炎型DHAV-1。
[0018] 該胰腺炎型鴨1型甲肝病毒弱毒疫苗株A75在預防雛鴨胰腺炎型鴨1型甲肝病毒 病中，特別是疫苗的制作中具有很好的效果。
[0019] 用該胰腺炎型鴨1型甲肝病毒弱毒疫苗株A75制作疫苗的方法如下： 將該胰腺炎型鴨1型甲肝病毒弱毒疫苗株A75,作為疫苗生產種子，以細胞培養基維持 液作稀釋10倍，接種在鴨成纖維細胞上，當細胞病變達到80%時，把細胞培養瓶轉入-80°C 冰箱反復凍融兩次后，收集病毒懸液，進行無菌檢驗達標后，以l〇〇〇〇rpm離心15分鐘，收集 離心后的上清液，分裝5mL(用于純凈性檢驗和TCID5(I測定)，其余冷藏保存。
[0020] 致弱病毒活疫苗的安全性檢驗： 將1日齡雛番鴨(無鴨1型甲肝病毒母源抗體)60只隨機均分為甲乙丙丁組，甲組每只 肌肉注射病毒液0.lmL，乙組每只肌肉注射病毒液0. 5mL，丙組每只肌肉注射病毒液lmL，丁 組為空白對照，觀察癥狀，于免疫后第3d，7d，14d，21d和28d時每組抽3只番鴨剖解，觀察 病理變化，取胰腺和肝臟固定于10%福爾馬林溶液中，制作病理切片，觀察組織顯微變化， 評價致弱株安全性。
[0021] 結果：每只肌肉注射，觀察35d，結果一、二、三和四組番鴨胰臟和肝臟均未出現眼 觀病理變化和顯微變化。不管是大劑量、中等劑量還是小劑量病毒液免疫1日齡雛番鴨，在 觀察時間內，均未出現不良反應，表明制備的致弱病毒疫苗安全性良好。
[0022] 致弱病毒活疫苗的免疫保護試驗： 將1日齡雛番鴨(無鴨1型甲肝病毒母源抗體)60只，隨機分為2組，30只/組，其中1 組每只腿部肌肉注射致弱病毒液0.lmL(TCID5Ql(T7_75/0.lmL)，另一組注射細胞培養基維持 液作為對照，免疫后7d，對所有鴨進行采血、分離血清和抗胰腺炎型鴨1型甲肝病毒抗體測 定，同時每只鴨肌注5Xl〇4 5TCIDj夷腺炎型鴨1型甲肝病毒，觀察14d，紀錄數據。
[0023] 結果：30只雛番鴨免疫后中和抗體滴度平均為25 6。細胞培養基維持液對照鴨抗 體為陰性。
[0024] 肌注5Xl〇4 5TCID5(l胰腺炎型鴨1型甲肝病毒：疫苗免疫組有1只出現臨床癥狀， 5天后逐漸康復，保護率達到96. 7%。
[0025] 胰腺炎型鴨1型甲肝病毒弱毒活疫苗的應用 取1日齡雛番鴨(無鴨1型甲肝病毒母源抗體）330只，每只腿部肌肉注射致弱病毒液 0.l