抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體雜交瘤及其單克隆抗體與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及細胞工程技術領域，更具體地，涉及抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗 體雜交瘤及其單克隆抗體與應用。
【背景技術】
[0002] 結直腸癌（colorectalcancer，CRC)是西方國家最常見的實體瘤，約占惡性腫瘤 死亡率的10%。在美國結直腸癌居惡性腫瘤死因的第二位，每年大約有52,000例結直腸癌 患者死亡。近年來，我國結直腸癌發病率也呈上升趨勢，居第五位惡性死因。結直腸癌患者 在疾病過程約有一半會進展為肝轉移，其中30%的患者肝臟為惟一的轉移部位，15~35% 的結直腸癌患者初診時發現同時性肝轉移，20~25%的患者隨后出現異時性肝轉移。肝轉 移是結直腸癌常見死因，近一半以上患者會死于肝轉移。結直腸癌肝轉移患者如果放棄治 療則預后極差，中位生存時間為6~12個月，盡管經過全身化療，但肝轉移瘤無法切除，患 者的中位生存時間只有12~24個月，生存時間超過5年者罕見，結直腸癌同時性或異時性 肝轉移一直是困擾臨床醫生的難題，如何盡早發現結直腸癌肝轉移，或在結直腸癌根治術 后對于肝轉移危險度進行評估，并指導術后治療是目前面臨的重要挑戰。對結直腸癌術后 肝轉移發生危險進行預測，有助于術后進行有針對性的輔助治療，從而提高整體生存率。
[0003]結直腸癌肝轉移是一復雜而連續的過程，首先癌細胞從原發癌灶脫離，降解胞外 基質脫離原發灶進入門靜脈，隨后通過信號傳導，在相關受體和因子的作用下到達肝臟，穿 出血管重新粘附，進而在肝臟形成新生血管、再增殖，最終使肝轉移灶形成。在此過程中各 種粘附分子、血管新生因子、細胞外金屬基質蛋白酶等都產生作用。目前臨床上用以檢測結 直腸癌肝轉移灶的方法主要是通過B超、CT、MR和DSA等影像學手段，但對肝轉移灶的檢查 率僅為50~90%，而且對直徑lcm以下的微小轉移灶，很難做出明確的診斷，術中探查雖也 可發現一些早期結直腸癌肝轉移病灶，但當轉移病灶直徑小于4_時，探查發現率大為降 低。早期因臨床癥狀不典型，CEA、CA19-9等腫瘤標志物又缺乏特異性，診斷相對困難。無 論是結直腸癌初次確診時即己發現的肝轉移，抑或根治術后再發生的肝轉移，確診時僅有 1/4~1/3的肝轉移灶局限于一葉肝臟，大多數已經累及兩葉，并且為多發，難以手術切除。 因此，肝轉移癌的早期正確診斷對指導治療，改善預后非常重要。尋找有效且穩定的早期診 斷結直腸癌肝轉移的生物學標志物，將對結直腸癌肝轉移的臨床診斷和治療產生深遠的影 響。
[0004] 翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP)，又稱P21 (小鼠TCTP)、P23 (人TCTP)、Q23,是一類廣泛 存在于動物、植物及酵母中在序列上高度保守且有很高同源性的蛋白家族，最初認為TCTP 是一類生長相關蛋白，近年的研宄提示TCTP具有非常重要的生物學功能，包括調節細胞周 期的進程和惡性轉移、鈣結合蛋白、細胞外組胺釋放蛋白、抗凋亡及抗瘧疾作用等；TCTP能 夠增強細胞的轉移能力，在結腸癌肝轉移病人血清中的含量顯著升高，檢測TCTP在血清中 的表達量對于監控結直腸癌的轉移有重要意義。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是克服現有結直腸癌肝轉移檢測技術所存在的 不能及時正確診斷的缺陷，提供一種抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞株 MQ-ANTI-TCTP-2,所述細胞株可分泌抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體。
[0006] 本發明的第二個目的是提供上述雜交瘤細胞株分泌的抗人翻譯控制腫瘤蛋白單 克隆抗體。
[0007] 本發明的第三個目的是提供上述抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體的應用。
[0008] 本發明的第四個目的是提供含有上述抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體的免疫 檢測試劑盒。
[0009] 本發明的目的是通過以下技術方案予實現的： 一種抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞株MQ-ANTI-TCTP-2,其分類命名為 人翻譯控制腫瘤蛋白（Hu-TCTP)單克隆抗體雜交瘤細胞，所述細胞株于2014年10月20日 保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo. 9812,保藏 地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。
[0010] 上述雜交瘤細胞株的制備方法如下：取血清效價大于1 :104的BALB/c小鼠脾細 胞與SP2/0骨髓瘤細胞按常規方法用50%PEG-4000進行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培養基篩選融合細胞，用重組表達的人翻譯控制腫瘤蛋白包被ELISA板進行 ELISA篩選；經過多次有限稀釋，最后獲得穩定分泌抗人翻譯控制腫瘤蛋白的雜交瘤細胞 株。
[0011] 由上述雜交瘤細胞株分泌獲得的抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體；優選地，所 述單克隆抗體為IgGl型，輕鏈均為K鏈。
[0012] 所述抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體的制備方法：應用保藏編號為CGMCC No. 9812的株雜交瘤細胞以IX106/只的量注入石蠟預處理的8~10周齡的BALB/c雌性 小鼠腹腔，飼養觀察10~14天后小鼠腹部膨大時抽取腹水。采用親和色譜法ProteinG SepharoseFastFlow純化單克隆抗體，并通過SepharoseS-200分子篩脫鹽，PBS洗脫，以 SDS-PAGE測定單克隆抗體的純度，純度達到90%以上。
[0013] 上述任意一種抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體在制備腫瘤診斷試劑中的應用； 優選地，所述腫瘤為結直腸癌。
[0014] 含有上述抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體的免疫檢測試劑盒，所述免疫檢測試 劑盒還含有標記物，所述標記物為熒光標記物、放射性標記物或酶標記物。
[0015] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果： 本發明提供了一種抗人翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP)單克隆抗體，所述單克隆抗體由雜 交瘤細胞株MQ-ANTI-TCTP-2分泌獲得，目前尚未有國產化的TCTP的抗體，國外可以檢測 TCTP的抗體產品存在價格昂貴、效價低、與天然TCTP蛋白反應效果不佳等缺點，本發明所 述單克隆抗體純化后，通過免疫熒光染色和免疫組化染色證明其能識別天然的人翻譯控制 腫瘤蛋白；另外，通過純化單克隆抗體對結直癌細胞SW480和Lovo進行Western-blot證 明了該單克隆抗體可以識別變性的人翻譯控制腫瘤蛋白；本發明所述單克隆抗體能用于 ELISA、化學發光、western-blot、免疫熒光以及組織的免疫組織化學檢測，為人翻譯控制腫 瘤蛋白功能研宄和其作為結直腸癌腫瘤肝轉移標志物的臨床標本驗證工作提供支持。
[0016] 含有本發明上述單克隆抗體的試劑盒進行檢測時，靈敏度高（0.1 ng/mL)，特異性 強，檢測范圍寬，操作簡便，無放射性污染，試劑盒成本低，臨床適應性強，更適合用于我國 臨床臨床檢測篩查。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發明單抗A2對結直癌細胞免疫印跡的結果，其結合條帶的分子量為 23kDa附近。
[0018] 圖2為本發明單抗A2對結直癌細胞Lovo免疫熒光染色的結果。
[0019] 圖3為本發明單抗A2進行化學發光檢測的標準曲線。
[0020] 圖4為本發明單抗A2對肝癌組織免疫組織化學染色的結果（顯微鏡放大倍數100 倍）。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本 發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的簡單 修改或替換，均屬于本發明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術 人員所熟知的常規手段。
[0022] 實施例1雜交瘤細胞株的制備 一、重組人翻譯控制腫瘤蛋白抗原制備 從結直腸癌細胞Lovo中調取TCTP基因，構建原核重組表達載體pET22b(+) /TCTP，在大 腸桿菌EscherichiacoliBL21中表達，利用NiSepharose親和層析純化柱進行純化，獲 得純度達90%以上的重組人TCTP蛋白（氨基酸序列如SEQIDN0 :1所示）。
[0023] 其中，擴增人翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP)基因的引物序列為： 上游引物：5'-GTCGGATCCATGATTATCTACCGG-3'（SEQIDN0:2); 下游引物：5'-TTGCGGCCGCTTMCAmTTCCAITTCTAAACCA-3'（SEQIDN0:3);其中，上游 引入BamHI內切酶位點，下游引入NotI內切酶位點。
[0024] 二、小鼠免疫 取純化的TCTP重組蛋白與250y1弗氏佐劑佐劑混合，以100yg/500y1的量腹部皮 下多點注射BALB/c小鼠，間隔三周以1100yg/500y1的量腹部皮下多點注射BALB/c小 鼠，從第三次免疫開始，每次免疫后的第二周尾靜脈采集小鼠血，間接ELISA方法檢測血清 效價達到1 :50000以上后準備細胞融合，融合前3天，尾靜脈注射加強免疫一次，抗原劑量 100yg。弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均使用商品化廣品。
[0025] 三、免疫血清效價測定 采用間接ELISA法測定免疫血清效價。取30ygTCTP重組蛋白溶解于10ml0. 05M，PH9. 6的碳酸鹽緩沖液，包被聚苯乙烯微96孔板，100y1/孔，4°C過夜。次日，使用PBS(含 有0. 1 % (V/V)Tween-20)洗板三次，用10mMPBS含10%新生牛血清封閉液200y1/孔， 37°C封閉lh，使用PBS(含有0. 1% (V/V)Tween-20)洗板三次，小鼠于第三次免疫后15天 尾靜脈采血，鼠免疫血清用含2%新生牛血清、10mMPBS以KT1~10 _8倍稀釋，加入96孔 板，lOOy1/孔，37°Clh，PBS(含有 0? 1% (V/V)Tween-20)洗板三次后，加入 1 :10000 倍稀 釋辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG(Sigma，INC. )，100y1/孔，37°C孵育lh，同上洗板后， TMB顯色，100y1/孔，室溫避光20min，加50y1/孔2M職04終止反應，測450nm吸收值， 以免疫前小鼠血清作為陰性對照，以測定值與對照值的比多2. 1為陽性來判斷免疫血清的 效價。
[0026]四、雜交瘤的制備 取血清效價大于1 :1〇4的小鼠，融合前3天，取重組抗原與等體積的PBS混勻后，以每 只100yg/500yL的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠進行加強免疫。無菌取小鼠脾臟，制 成脾細胞懸液與對數生長期的小鼠骨髓瘤細胞株SP20按10 :1的比例混