基于ca125抗原的dc細胞、靶向性免疫細胞群及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體地，本發明涉及DC細胞、靶向性免疫細胞群及其 制備方法和用途。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤是人類主要的致死性疾病類型，死亡率居高不下。衛生部最新統計數據 表明惡性腫瘤居我國居民前十位死因首位。2010年中國惡性腫瘤發病患者268萬人，死亡 197萬人；目前全國共有惡性腫瘤患者600余萬人。每年用于惡性腫瘤病人的醫療費用約 占衛生總費用的20%，是全社會最大的醫療負擔。目前的治療手段對于達到治愈、延長惡性 腫瘤患者生存期以及改善生活質量等目標的作用仍然十分有限，尤其對于某些類型的惡性 腫瘤即使是早期診斷也難以獲得滿意的療效，至于轉移性、全身性或進展期的惡性腫瘤則 更難以治愈。
[0003] 目前的腫瘤治療策略中，手術和放療等局部治療對局限性腫瘤有較好的療效，而 對于全身性、轉移性或局部治療后的微小殘留病灶則主要依靠化療或免疫療法進行系統性 治療。腫瘤發病是多步驟、多基因作用的結果，腫瘤細胞表現出生長、分化與凋亡的失控。臨 床上病人癥狀的多樣性和個體遺傳異質性，以及腫瘤遠處轉移病灶的出現，使腫瘤治療必 須以全身性疾病的觀點，采用個體化的綜合治療方案。即根據每個腫瘤病人的特點，采用局 部治療結合全身治療；不僅要消除局部病灶的腫瘤，還要控制腫瘤的復發、轉移生長及腫瘤 對重要臟器的侵襲，才能真正有效地提高腫瘤病人的治愈率和生存期。通常腫瘤局部病灶 的治療可采取手術和物理治療（包括射頻消融、熱療、放療、冷凍、超聲波及激光治療等）方 法消除，然而對于影像學不能發現的腫瘤微小病灶（如轉移復發灶、局部治療后的殘留病 灶、血液中的癌細胞），以上局部治療手段則無能為力，必須通過全身性治療手段加以解決。 由于腫瘤的轉移、復發、擴散更為致命，因此全身性治療顯得尤為重要和緊迫。目前全身性 治療有傳統化學治療、分子祀向藥物治療、生物治療（包括干細胞移植治療和免疫細胞治 療）以及基因治療等。傳統化療雖然在某些腫瘤治療方面取得了一些進展，但對延長腫瘤 病人生存期方面仍然貢獻不大。而且腫瘤細胞對化療藥的天然耐藥和獲得性多藥耐藥以及 化療毒性，使化學治療的發展受到了嚴重的妨礙。多年來的臨床實踐證明它并非是全身治 療的優勢項目。
[0004] 免疫細胞治療是近二十年發展起來的，免疫細胞治療主要包括CIK和DC細胞。由 于它治療范圍廣（可用于實體腫瘤及白血病），特別對腫瘤微小病灶（包括轉移、復發灶、 血液中的癌細胞）更為有效，無毒副作用，而且適用于腫瘤各階段（如晚期放、化療不能使 用）；因此它是全身治療的一個優勢項目。免疫細胞治療對提高生命質量、延長生存期有顯 著的效果，倍受國內外推崇，是目前全身治療的最佳手段之一，臨床潛力巨大。
[0005] 然而，目前用于進行免疫細胞治療的免疫細胞的制備方法仍有待改進。
【發明內容】
[0006] 本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的 在于提出一種安全、高效的制備DC細胞和靶向性免疫細胞群的方法。
[0007] 需要說明的是，本發明是基于發明人的下列發現而完成的：
[0008] 隨著生物治療技術的發展，對惡性腫瘤進行免疫治療已成為研宄熱點，免疫治療 是腫瘤治療的一種嶄新模式，尤其是細胞介導的過繼免疫治療已較為成熟已經進入臨床應 用階段，并取得了明顯的治療效果。細胞介導的過繼免疫治療已成為腫瘤患者放、化療后輔 助治療的重要手段之一，其對于促進患者免疫系統的重建、消除殘留病灶及骨髓凈化都具 有良好效果。人們通過研宄淋巴因子一激活的殺傷（LAK)細胞、腫瘤浸潤淋巴（TIL)細胞、 細胞因子誘導的殺傷（CIK)細胞等，表明CIK細胞是一種新型、高效、具有廣譜殺瘤活性的 非主要組織相容性復合體（MHC)限制性免疫效應細胞，在腫瘤免疫治療中顯露出巨大的應 用價值。樹突狀細胞OC)是人體內功能強大的主要的抗原遞呈細胞，能誘導出抗原特異性 細胞毒淋巴細胞（CTL)反應并可通過直接或間接方式影響0細胞（胰腺的胰島中能產生 胰島素的細胞）的增殖，活化體液免疫應答。將CIK細胞和DC聯合治療惡性腫瘤，有助于 解除腫瘤患者的T細胞免疫無能，有協同抗腫瘤的作用。越來越多的試驗和臨床實踐表明 的細胞因子誘導的殺傷細胞聯合樹突狀細胞對惡性腫瘤的治療（CIK/DC細胞治療）顯示出 良好的治療效果，有著巨大的發展潛力和應用前景。
[0009] 其中，CTL細胞是⑶8+的T細胞亞群，為一種特異T細胞，對某些病毒、腫瘤細胞 等具有直接殺傷作用，與自然殺傷細胞構成機體抗病毒、抗腫瘤的重要防線。CTL殺傷機制 有：①釋放穿孔素，顆粒酶，裂解靶細胞。②通過FasL介導靶細胞的凋亡。
[0010] 基于DC的抗原負載技術主要類型有：腫瘤抗原肽沖擊DC;腫瘤細胞性抗原沖擊 DC;腫瘤細胞RNA沖擊DC;基因修飾DC的免疫治療。發明人發現，腫瘤抗原多肽負載DC是 應用腫瘤抗原多肽在體外沖擊致敏DC，然后回輸或免疫接種至荷瘤宿主，能明顯誘導機體 產生抗原特異性CTL，產生保護性免疫反應，目前所有的dc負載抗原作為疫苗來開發的，在 機體內產生抗體及CTL，沒有在體外制備CTL細胞。由于抗原在體內激起的免疫反應有可能 產生系統性字體免疫的可能，發明人利用該技術在體外制備CTL細胞及綜合免疫細胞群， 可以解決目前的問題。另外，目前有用各種載體作為抗原，rAAv等病毒類載體負載抗原制 備CTL技術的，ACTL技術就是其中之一，但是由于病毒的整合特性，導致DC細胞的基因組 毒性問題一直解決不了，所以發明人利用mRNA抗原技術替代病毒類或DNA類的載體，從安 全性上超過了病毒類載體，同時從產業化角度上來看，mRNA體外轉錄更能實現產業化，操作 簡單，質控及質檢可以標準化。
[0011] 換言之，本發明利用mRNA-DC-CTL技術制備靶向性免疫細胞群，具體地：將腫 瘤相關抗原決定簇的mRNA轉染患者的外周血單核細胞（Monocytes)，經細胞因子誘導， 單核細胞轉化為具有強大抗原提呈功能的DC細胞。將經此技術獲得的DC細胞，在體 外刺激患者的T淋巴細胞，產生有效殺傷腫瘤細胞的細胞毒性T淋巴細胞（CytotoxicT lymphocytes,CTL)。所產生的CTL具有腫瘤抗原特異性，即祀向性，僅針對某種或數種特定 腫瘤相關抗原陽性的腫瘤細胞具有殺傷作用，對抗原陰性的細胞無任何作用。
[0012] 進而，根據本發明的一個方面，本發明提供了一種制備DC細胞的方法。根據本發 明的實施例，該方法包括以下步驟：將單核細胞進行第一誘導分化培養，以便獲得未成熟的 DC細胞；利用CA125抗原mRNA轉染所述未成熟的DC細胞，以便獲得經過轉染的未成熟DC細胞；以及將所述經過轉染的未成熟DC細胞進行第二誘導分化培養，以便獲得成熟的DC細 胞，其中，所述單核細胞是從樣本的外周血單個核細胞中分離獲得的。
[0013] 發明人驚奇地發現，利用本發明的方法能夠安全高效地制備DC細胞（即樹突狀細 胞），且本發明的方法成本低、效率高、且能夠有效地解決細胞毒性問題，獲得的DC細胞回 輸患者后安全無毒，能夠有效用于免疫細胞治療，且該DC細胞還能夠有效用于刺激同樣患 者來源的淋巴細胞產生富含大量CTL細胞的靶向性免疫細胞群，進而用于腫瘤免疫治療后 效果更好。
[0014] 另外，根據本發明上述實施例的制備DC細胞的方法還可以具有如下附加的技術 特征：
[0015] 根據本發明的實施例，所述CA125抗原mRNA是通過以下步驟獲得的：制備CA125 抗原cDNA質粒，所述CA125抗原cDNA的核酸序列如SEQIDNO: 1所示；將所述CA125抗原 cDNA質粒進行線性化處理，以便獲得經過線性化處理的CA125抗原cDNA質粒；以及將所述 經過線性化處理的CA125抗原cDNA質粒進行體外轉錄，以便獲得CA125抗原mRNA。由此， 能夠有效制備獲得CA125抗原mRNA。
[0016] 根據本發明的實施例，以pcDNA3. 1載體為骨架載體，制備所述CA125抗原cDNA質 粒。由此，制備效率高，效果好。
[0017] 根據本發明的實施例，所述pcDNA3. 1載體具有BamhI、Xbal和Bstll07I酶切位 點。由此，能夠有效進行質粒克隆和后續的線性化處理。
[0018] 根據本發明的實施例，基于酶切位點Bstll07I進行所述線性化處理。
[0019] 根據本發明的實施例，利用ITMessage Machine試劑盒進行所述體外轉錄。由此， 轉錄效率高、效果好。
[0020] 根據本發明的實施例，在進行所述體外轉錄后，進一步包括除雜純化的步驟。由 此，有利于后續CA125抗原mRNA轉染的進行。
[0021] 根據本發明的實施例，利用電轉或PEI法進行所述轉染。由此，轉染效率高、效果 好。
[0022] 根據本發明的實施例，利用PEI法進行所述轉染，其中，PEI與所述CA125抗原 mRNA的混合質量比為3:1。由此，轉染效果突出。
[0023] 根據本發明的實施例，利用DC培養基進行所述第一誘導分化培養和所述第二誘 導分化培養。由此，能夠有效誘導獲得DC細胞。
[0024] 根據本發明的實施例，所述DC培養基包含：無血清細胞培養基；100~1000U/ml 的CTL4因子；以及2體積％~10體積％的自體血清，其中，所述血清來源于所述樣本。由 此，培養效果好。根據本發明的實施例，所述無血清培養基為Takara的無血清培養基。根 據本發明的另一些實施例，所述無血清培養基中添加有0. 5體積％~5體積％的抗生素，優 選慶大霉素。由此，培養效果突出。
[0025] 根據本發明的實施例，進行所述第一誘導分化培養4-5天，每2-3天半換液一次。 根據本發明的實施例，進行所述第二誘導分化培養4-5天，每2-3天半換液一次。由此，培 養效果好。
[0026] 根據本發明的另一方面，本發明還提供了一種制備靶向性免疫細胞群的方法。根 據本發明的實施例，該方法包括以下步驟：提供樣本的外周血單個核細胞；將所述樣本的 外周血單個核細胞分離為淋巴細胞和單核細胞；將所述淋巴細胞進行活化培養，以便獲得 經過活化培養的淋巴細胞；將單核細胞進行第一誘導分化培養，以便獲得未成熟的DC細 胞；利用CA125抗原mRNA轉染所述未成熟的DC細胞，以便獲得經過轉染的未成熟DC細胞； 將所述經過轉染的未成熟DC細胞進行第二誘導分化培養，以便獲得成熟的DC細胞；以及將 所述成熟的DC細胞與所述經過活化培養的淋巴細胞進行混合培養，以便獲得靶向性免疫 細胞群。
[0027] 發明人驚奇地發現，利用本發明的方法能夠有效制備獲得靶向性免疫細胞群，該 靶向性免疫細胞群不僅具有強大殺傷特定腫瘤細胞的CTL細胞，還有CIK、NK等免疫細胞， 能夠有效用于免疫細胞治療。此外，本發明的方法成本低、效率高，且能夠有效地解決細胞 毒性問題，獲得的靶向性免疫細胞群回輸患者后安全無毒。
[0028] 根據本發明的實施例，所述CA125抗原mRNA是通過以下步驟獲得的：制備CA125 抗原cDNA質粒，所述CA125抗原cDNA的核酸序列如SEQIDNO: 1所示；將所述CA125抗原 cDNA質粒進行線性化處理，以便獲得經過線性化處理的CA125抗原cDNA質粒；以及將所述 經過線性化處理的CA125抗原cDNA質粒進行體外轉錄，以便獲得CA125抗原mRNA。由此， 能夠有效制備獲得CA125抗原mRNA。
[0029] 根據本發明的實施例，以pcDNA3. 1載體為骨架載體，制備所述CA125抗原cDNA質 粒。由此，制備效率高，效果好。
[0030] 根據本發明的實施例，所述pcDNA3. 1載體具有BamhI、Xbal和Bstll07I酶切位 點。由此，能夠有效進行質粒克隆和后續的線性化處理。
[0031] 根據本發明的實施例，基于酶切位點Bstll07I進行所述線性化處理。
[0032] 根據本發明的實施例，利用ITMessageMachine試劑盒進行所述體外轉錄。由此， 能夠有效進行質粒克隆和后續的線性化處理。
[0033] 根據本發明的實施例，在進行所述體外轉錄后，進一步包括除雜純化的步驟。由 此，有利于后續CA125抗原mRNA轉染的進行。
[0034] 根據本發明的實施例，利用電轉或PEI法進行所述轉染。由此，轉染效率高、效果 好。
[0035] 根據本發明的實施例，利用PEI法進行所述轉染，其中，PEI與所述CA125抗原 mRNA的混合質量比為3:1。由此，轉染效果突出。
[0036] 根據本發明的實施例，所述活化培養包括：利用CTL1細胞培養基對所述淋巴細胞 進行第一活化培養24小時；利用CTL2細胞培養基對經過第一活化培養的淋巴細胞進行第 二活化培養2-3天；以及利用CTL3細胞培養基對經過第二活化培養的淋巴細胞進行第三活 化培養4-5天，每隔2-3天等量補液一次。由此，能夠有效使淋巴細胞活化，有利于后續靶 向性免疫細胞群的獲得。
[0037] 根據本發明的實施例，所述CTL1細胞培養基包含：無血清細胞培養基；
[0038] 100~1000U/ml的CTL1因子；以及2體積％~10體積％的自體血清，所述CTL2 細胞培養基包含：無血清細胞培養基；100~l〇〇〇U/ml的CTL2因子；以及2體積％~10體 積％的自體血清，所述CTL3細胞培養基包含：無血清細胞培養基；100~1000U/ml的CTL3 因子；以及2體積％~10體積％的自體血清，其中，所述血清來源于所述樣本。由此，活化 培養效果好。根據本發明的實施例，所述無血清培養基為Takara的無血清培養基。根據本 發明的另一些實施例，所述無血清培養基中添加有0. 5體積％~5體積％的抗生素，優選慶 大霉素。由此，活化培養效果突出，淋巴細胞活化效果好，有利于后續靶向性免疫細胞群的 獲得。
[0039] 根據本發明的實施例，利用DC培養基進行所述第一誘導分化培養和所述第二誘 導分化培養。由此，能夠有效誘導獲得DC細胞。
[0040] 根據本發明的實施例，所述DC培養基包含：無血清細胞培養基；100~1000U/ml 的CTL4因子；以及2體積％~10體積％的自體血清，其中，所述血清來源于所述樣本。由 此，培養效果好。根據本發明的實施例，所述無血清培養基為Takara的無血清培養基。根 據本發明的另一些實施例，所述無血清培養基中添加有0. 5體積％~5體積％的抗生素，優 選慶大霉素。由此，培養效果突出。
[0041] 根據本發明的實施例，進行所述第一誘導分化培養4-5天，每2-3天半換液一次。 根據本發明的實施例，進行所述第二誘導分化培養4-5天，每2-3天半換液一次。由此，培 養效果好。
[0042] 根據本發明的實施例，利用CTL3細胞培養基進行所述混合培養6-8天，優選7天。 由此，能夠有效獲得靶向性免疫細胞群。
[0043] 根據本發明的實施例，所述CTL3細胞培養基包含：無血清細胞培養基；100~ 1000U/ml的CTL3因子；以及2體積％~10體積％的自體血清，其中，所述血清來源于所述 樣本。由此，培養效果好。根據本發明的實施例，所述無血清培養基為Takara的無血清培 養基。根據本發明的另一些實施例，所述無血清培養基中添加有〇. 5體積％~5體積％的 抗生素，優選慶大霉素。由此，能夠高效地制備獲得靶向性免疫細胞群。
[0044] 根據本發明的實施例，按照所述成熟的DC細胞與所述經過活化培養的淋巴細胞 的體積比為1 :20進行所述混合培養。由此，混合培養效果好，能夠高效地制備獲得靶向性 免疫細胞群。
[0045] 此外，根據本發明的另一些實施例，本發明的制備靶向性免疫細胞群的方法還可 以包括以下步驟：
[0046] 第一步：抽取腫瘤患者靜脈外周血（50-100毫升）或采用血細胞分離機直接分離 出外周血單個核細胞（PBMC)。
[0047] 第二步：經培養，PBMC被分離為淋巴細胞和單核細胞，淋巴細胞繼續培養，備用； 利用CA125抗原mRNA轉染單核細胞，并利用細胞因子誘導成熟的樹突狀細胞（DC)產生。
[0048] 第三步：將成熟的DC細胞與淋巴細胞混合培養，將淋巴細胞誘導成為具有抗原特 異性的、殺傷抗原陽性腫瘤細胞的細胞毒性T淋巴細胞，獲得靶向性免疫細胞群。
[0049] 根據本發明的又一方面，本發明還提供了一種靶向性免疫細胞群。根據本發明的 實施例，其是通過前面所述的制備靶向性免疫細胞群的方法制備獲得的。發明人發現，本發 明的靶向性免疫細胞群不僅具有強大殺傷特定腫瘤細胞的CTL細胞，還有CIK、NK等免疫細 胞，且成本低、安全無毒，能夠有效用于免疫細胞治療。
[0050] 根據本發明的再一方面，本發明還提供了靶向性免疫細胞群、以及利用前面所述 的制備DC細胞的方法制備獲得的DC細胞在制備藥物中的用途，所述藥物用于抑制腫瘤轉 移、擴散、復發。
[0051] 根據本發明的實施例，所述腫瘤為CA125抗原陽性腫瘤，優選乳腺癌。
[0052] 需要說明的是，發明人發現，由于mRNA無需啟動子，不能無限制的擴增，不會進入 細胞核插入宿主細胞染色體上，無遺傳基因毒性，具很高的安全性等特點，因而本發明擬用 mRNA-DC-CTL方法制備DC細胞以及靶向性免疫細胞群（針對CA125的靶向性免疫細胞集 群），以便用于腫瘤的免疫治療。本發明的方法突破了以往的刺激DC的藥物不能常規制備 的局限性。并且，在體外利用mRNA轉染DC而產生特異性多靶點CTL細胞的屬于第一次。
[0053] 具體地，本發明的方法具有以下優點的至少之一：
[0054] 1、國際上首次構建出CA125mRNA抗原。
[0055] 2、國際上首次利用CA125抗原mRNA轉染DC細胞來體外誘導獲得CA125特異性的 靶向免疫細胞群（富含CTL細胞）。
[0056] 3、本發明的靶向免疫細胞群包含：CTL細胞（CD8+，CD3+CD8+CD28+)，CIK細胞 (⑶3+⑶56+)，NK細胞（⑶3-⑶56+)，使其不僅具有強大殺傷特定腫瘤細胞的CTL細胞，還有 CIK、NK等免疫細胞，可以提升患者的整體免疫力，明顯改善患者的癥狀，能幫助免疫反應更 加完整、效能更尚。
[0057] 4、靶向免疫細胞群制備的整個過程僅需要12-14天。
[0058] 本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
【附圖說明】
[0059] 本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中：
[0060] 圖1顯示了根據本發明一個實施例，CA125抗原cDNA質粒構建過程中質粒酶切鑒 定的結果；
[0061] 圖2顯示了根據本發明一個實施例，GFP檢測mRNA轉染后效果的結果圖；
[0062] 圖3顯示了根據本發明一個實施例，基于靶向性免疫細胞群的流式細胞儀檢測結 果獲得的統計分析結果。
【具體實施方式】
[0063] 需要說明的是，術語"第一"、"第二"僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相 對重要性或者隱含指明所指示的技術特征的數量。由此，限定有"第一"、"第二"的特征可 以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。進一步地，在本發明的描述中，除非另有說 明，"多個"的含義是兩個或兩個以上。
[0064] 下面將結合實施例對本發明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面的 實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條 件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件（例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等 譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社）或者按照產品說明書進行。所用試劑或 儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品，例如可以采購自Illumina公 司。
[0065] 實施例1 :
[0066] -、材料與設備
[0067] 1、實驗室級別：GLP
[0068] 2、儀器設備：
[0069] 負80度超低溫冰箱（中科美菱，DW-HL388);普通冰箱（海爾，雙開門，-20°C 和4°C);霉菌培養箱（上海博迅，MJX-160B-Z);恒溫水浴箱（SSW-420-2S) ;C02培養箱 (HF240);低速離心機（上海安亭，TDL-40C);倒置生物顯微鏡（科信，型號：BLD-1);生物 安全柜（蘇州凈化，雙人）；電動移液器（德國普蘭德）l-l〇ml;微量移液槍（大龍）1套，4 把；程序降溫盒（Thermo);液氮罐（金鳳，YDS-120-216) ;PCR儀；凝膠電泳成像系統；電泳 儀；恒溫儀；
[0070] 3、細胞培養耗材：
[0071] 細胞培養袋〇^1?^1公司）；75〇112培養瓶、175〇11 2培養瓶、1.81111凍存管、1.51111￡? 管、50ml離心管、15ml離心管，均來自美國Coning公司；0? 22um針頭濾器（美國BD公司）； lOOum細胞篩網（美國BD公司）；30ml注射器（上海醫療器械）。
[0072] 4、細胞培養試劑：
[0073] 無血清細胞培養基（Takara，貨號：GT-T561);澳大利亞胎牛血清（FBSQUALIFIED AUSTRALIAORIGIN)，Gibco,貨號：10099-141 ;
[0074] 淋巴細胞分離液Ficoll液（GE，貨號：17-1440-02);
[0075]青霉素/鏈霉素雙抗溶液（PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL，PS)，Gibco,貨號： 15140-122。
[0076] 5、培養基的配制：
[0077]5. 1試劑：
[0078]CTL1因子（包括y干擾素，1000U/ml) :1ml，-20°C長期保存，4°C保存2周；
[0079]CTL2 因子（包括IL-l，1000U/ml;IL-2，1000U/ml;CD3 抗體，100ng/ml;CD28 抗體， lOOng/ml) :1ml，-20°C長期保存，4°C保存 2 周；
[0080] CTL3 因子（包括IL-2，1000U/ml;IL-7,20ng/ml;IL-15,20ng/ml) :1ml，-20°C長 期保存，4°C保存2周；
[0081] CTL4 因子（包括GM-CSF，1000U/ml;IL-4, 500U/ml;TNF-a，500U/ml;IL