基于hm1.24抗原的dc細胞、靶向性免疫細胞群及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體地，本發明涉及DC細胞、靶向性免疫細胞群及其 制備方法和用途。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤是人類主要的致死性疾病類型，死亡率居高不下。衛生部最新統計數據 表明惡性腫瘤居我國居民前十位死因首位。2010年中國惡性腫瘤發病患者268萬人，死亡 197萬人；目前全國共有惡性腫瘤患者600余萬人。每年用于惡性腫瘤病人的醫療費用約 占衛生總費用的20%，是全社會最大的醫療負擔。目前的治療手段對于達到治愈、延長惡性 腫瘤患者生存期以及改善生活質量等目標的作用仍然十分有限，尤其對于某些類型的惡性 腫瘤即使是早期診斷也難以獲得滿意的療效，至于轉移性、全身性或進展期的惡性腫瘤則 更難以治愈。
[0003] 目前的腫瘤治療策略中，手術和放療等局部治療對局限性腫瘤有較好的療效，而 對于全身性、轉移性或局部治療后的微小殘留病灶則主要依靠化療或免疫療法進行系統性 治療。腫瘤發病是多步驟、多基因作用的結果，腫瘤細胞表現出生長、分化與凋亡的失控。臨 床上病人癥狀的多樣性和個體遺傳異質性，以及腫瘤遠處轉移病灶的出現，使腫瘤治療必 須以全身性疾病的觀點，采用個體化的綜合治療方案。即根據每個腫瘤病人的特點，采用局 部治療結合全身治療；不僅要消除局部病灶的腫瘤，還要控制腫瘤的復發、轉移生長及腫瘤 對重要臟器的侵襲，才能真正有效地提高腫瘤病人的治愈率和生存期。通常腫瘤局部病灶 的治療可采取手術和物理治療（包括射頻消融、熱療、放療、冷凍、超聲波及激光治療等）方 法消除，然而對于影像學不能發現的腫瘤微小病灶（如轉移復發灶、局部治療后的殘留病 灶、血液中的癌細胞），以上局部治療手段則無能為力，必須通過全身性治療手段加以解決。 由于腫瘤的轉移、復發、擴散更為致命，因此全身性治療顯得尤為重要和緊迫。目前全身性 治療有傳統化學治療、分子祀向藥物治療、生物治療（包括干細胞移植治療和免疫細胞治 療）以及基因治療等。傳統化療雖然在某些腫瘤治療方面取得了一些進展，但對延長腫瘤 病人生存期方面仍然貢獻不大。而且腫瘤細胞對化療藥的天然耐藥和獲得性多藥耐藥以及 化療毒性，使化學治療的發展受到了嚴重的妨礙。多年來的臨床實踐證明它并非是全身治 療的優勢項目。
[0004] 免疫細胞治療是近二十年發展起來的，免疫細胞治療主要包括CIK和DC細胞。由 于它治療范圍廣（可用于實體腫瘤及白血病），特別對腫瘤微小病灶（包括轉移、復發灶、 血液中的癌細胞）更為有效，無毒副作用，而且適用于腫瘤各階段（如晚期放、化療不能使 用）；因此它是全身治療的一個優勢項目。免疫細胞治療對提高生命質量、延長生存期有顯 著的效果，倍受國內外推崇，是目前全身治療的最佳手段之一，臨床潛力巨大。
[0005] 然而，目前用于進行免疫細胞治療的免疫細胞的制備方法仍有待改進。
【發明內容】
[0006] 本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的 在于提出一種安全、高效的制備DC細胞和靶向性免疫細胞群的方法。
[0007] 需要說明的是，本發明是基于發明人的下列發現而完成的：
[0008] 隨著生物治療技術的發展，對惡性腫瘤進行免疫治療已成為研宄熱點，免疫治療 是腫瘤治療的一種嶄新模式，尤其是細胞介導的過繼免疫治療已較為成熟已經進入臨床應 用階段，并取得了明顯的治療效果。細胞介導的過繼免疫治療已成為腫瘤患者放、化療后輔 助治療的重要手段之一，其對于促進患者免疫系統的重建、消除殘留病灶及骨髓凈化都具 有良好效果。人們通過研宄淋巴因子一激活的殺傷（LAK)細胞、腫瘤浸潤淋巴（TIL)細胞、 細胞因子誘導的殺傷（CIK)細胞等，表明CIK細胞是一種新型、高效、具有廣譜殺瘤活性的 非主要組織相容性復合體（MHC)限制性免疫效應細胞，在腫瘤免疫治療中顯露出巨大的應 用價值。樹突狀細胞OC)是人體內功能強大的主要的抗原遞呈細胞，能誘導出抗原特異性 細胞毒淋巴細胞（CTL)反應并可通過直接或間接方式影響0細胞（胰腺的胰島中能產生 胰島素的細胞）的增殖，活化體液免疫應答。將CIK細胞和DC聯合治療惡性腫瘤，有助于 解除腫瘤患者的T細胞免疫無能，有協同抗腫瘤的作用。越來越多的試驗和臨床實踐表明 的細胞因子誘導的殺傷細胞聯合樹突狀細胞對惡性腫瘤的治療（CIK/DC細胞治療）顯示出 良好的治療效果，有著巨大的發展潛力和應用前景。
[0009] 其中，CTL細胞是⑶8+的T細胞亞群，為一種特異T細胞，對某些病毒、腫瘤細胞 等具有直接殺傷作用，與自然殺傷細胞構成機體抗病毒、抗腫瘤的重要防線。CTL殺傷機制 有：①釋放穿孔素，顆粒酶，裂解靶細胞。②通過FasL介導靶細胞的凋亡。
[0010] 基于DC的抗原負載技術主要類型有：腫瘤抗原肽沖擊DC;腫瘤細胞性抗原沖擊 DC;腫瘤細胞RNA沖擊DC;基因修飾DC的免疫治療。發明人發現，腫瘤抗原多肽負載DC是 應用腫瘤抗原多肽在體外沖擊致敏DC，然后回輸或免疫接種至荷瘤宿主，能明顯誘導機體 產生抗原特異性CTL，產生保護性免疫反應，目前所有的dc負載抗原作為疫苗來開發的，在 機體內產生抗體及CTL，沒有在體外制備CTL細胞。由于抗原在體內激起的免疫反應有可能 產生系統性字體免疫的可能，發明人利用該技術在體外制備CTL細胞及綜合免疫細胞群， 可以解決目前的問題。另外，目前有用各種載體作為抗原，rAAv等病毒類載體負載抗原制 備CTL技術的，ACTL技術就是其中之一，但是由于病毒的整合特性，導致DC細胞的基因組 毒性問題一直解決不了，所以發明人利用mRNA抗原技術替代病毒類或DNA類的載體，從安 全性上超過了病毒類載體，同時從產業化角度上來看，mRNA體外轉錄更能實現產業化，操作 簡單，質控及質檢可以標準化。
[0011] 換言之，本發明利用mRNA-DC-CTL技術制備靶向性免疫細胞群，具體地：將腫 瘤相關抗原決定簇的mRNA轉染患者的外周血單核細胞（Monocytes)，經細胞因子誘導， 單核細胞轉化為具有強大抗原提呈功能的DC細胞。將經此技術獲得的DC細胞，在體 外刺激患者的T淋巴細胞，產生有效殺傷腫瘤細胞的細胞毒性T淋巴細胞（CytotoxicT lymphocytes,CTL)。所產生的CTL具有腫瘤抗原特異性，即祀向性，僅針對某種或數種特定 腫瘤相關抗原陽性的腫瘤細胞具有殺傷作用，對抗原陰性的細胞無任何作用。
[0012] 進而，根據本發明的一個方面，本發明提供了一種制備DC細胞的方法。根據本發 明的實施例，該方法包括以下步驟：將單核細胞進行第一誘導分化培養，以便獲得未成熟的 DC細胞；利用HM1. 24抗原mRNA轉染所述未成熟的DC細胞，以便獲得經過轉染的未成熟DC細胞；以及將所述經過轉染的未成熟DC細胞進行第二誘導分化培養，以便獲得成熟的DC細 胞，其中，所述單核細胞是從樣本的外周血單個核細胞中分離獲得的。
[0013] 發明人驚奇地發現，利用本發明的方法能夠安全高效地制備DC細胞（即樹突狀細 胞），且本發明的方法成本低、效率高、且能夠有效地解決細胞毒性問題，獲得的DC細胞回 輸患者后安全無毒，能夠有效用于免疫細胞治療，且該DC細胞還能夠有效用于刺激同樣患 者來源的淋巴細胞產生富含大量CTL細胞的靶向性免疫細胞群，進而用于腫瘤免疫治療后 效果更好。
[0014] 另外，根據本發明上述實施例的制備DC細胞的方法還可以具有如下附加的技術 特征：
[0015] 根據本發明的實施例，所述HM1. 24抗原mRNA是通過以下步驟獲得的：制備 HM1. 24抗原cDNA質粒，所述HM1. 24抗原cDNA的核酸序列如SEQIDNO:1所示；將所述 HM1. 24抗原cDNA質粒進行線性化處理，以便獲得經過線性化處理的HM1. 24抗原cDNA質 粒；以及將所述經過線性化處理的HM1. 24抗原cDNA質粒進行體外轉錄，以便獲得HM1. 24 抗原mRNA。由此，能夠有效制備獲得HM1. 24抗原mRNA。
[0016] 根據本發明的實施例，以pcDNA3. 1載體為骨架載體，制備所述HM1. 24抗原cDNA 質粒。由此，制備效率高，效果好。
[0017] 根據本發明的實施例，所述pcDNA3. 1載體具有BamhI、Xbal和Bstll07I酶切位 點。由此，能夠有效進行質粒克隆和后續的線性化處理。
[0018] 根據本發明的實施例，基于酶切位點Bstll07I進行所述線性化處理。
[0019] 根據本發明的實施例，利用ITMessage Machine試劑盒進行所述體外轉錄。由此， 轉錄效率高、效果好。
[0020] 根據本發明的實施例，在進行所述體外轉錄后，進一步包括除雜純化的步驟。由 此，有利于后續HM1. 24抗原mRNA轉染的進行。