一種三陰性乳腺癌順鉑耐藥細胞株及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫學技術領域，具體涉及一種乳腺癌耐藥細胞株，尤其涉及一種 三陰性乳腺癌順鉑耐藥細胞株及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002] 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，據統計，全球每年乳腺癌的發病人數約有 120萬人，約50萬人死于乳腺癌。隨著對乳腺癌的研宄不斷深入，目前認為乳腺癌是一種 高度異質性腫瘤，不同的病理特點和分子特征導致其對治療的反應和預后明顯不同。臨床 上根據免疫組化檢測的雌激素受體（estrogenreceptor，ER)、孕激素受體（progesterone receptor，PR)、人表皮生長因子受體 2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2， HER-2)、Ki67等的結果將乳腺癌分為不同的分子亞型，其中ER、PR、HER-2表達均陰性者被 稱為三陰性乳腺癌（triplenegativebreastcancer，TNBC)。該類乳腺癌患者無法從常 規內分泌治療和針對HER-2陽性的靶向治療中獲益，化療成為其主要的全身治療手段。但 是該型乳腺癌對化療藥物雖然敏感卻容易產生耐藥，化療耐藥的出現對TNBC患者的預后 影響重大。近年來，腫瘤耐藥細胞株已成為重要的研宄工具，許多研宄者利用它來揭示腫瘤 細胞的耐藥機制、研宄腫瘤細胞的耐藥性逆轉、開發及評價新的抗癌方法等，建立腫瘤耐藥 細胞株具有重要應用價值。
[0003] 雖然目前TNBC的輔助化療仍采用以紫衫類、蒽環類以及環磷酰胺為基礎的化療 方案，但自2006年Garber在SABCS會議上首次發表了使用單藥順鉑治療TNBC可達到50 % 的客觀緩解率（objectiveresponserate，0RR)和 22% 的病理完全緩解（pathological completeresponse，pCR)起，鉬類藥物用于TNBC的越來越成為研宄熱點。目前研宄認為 鉑類藥物作用于TNBC的機制在于：三陰性乳腺癌存在一定的DNA損傷修復障礙，而鉑類藥 物可以與雙鏈DNA交聯，阻滯DNA復制、轉錄并最終導致細胞死亡，因此三陰性乳腺癌對鉑 類藥物敏感性較高。臨床研宄也證明接受含鉑方案新輔助及輔助化療的乳腺癌患者的pCR 和cDR在TNBC患者均顯著高于非TNBC者。此外，由于含蒽環和紫杉類藥物的方案在新輔 助治療或術后輔助治療中的應用，使得患者在疾病復發轉移時常常對其已經耐藥，因此鉑 類藥物也是三陰性乳腺癌術后復發、轉移治療的有效選擇。
[0004]MDA-MB-231細胞是乳腺癌細胞株，是從一名51歲的白人女性乳腺癌患者的胸水 中分離建立的。經免疫組化鑒定該細胞株ER、PR、Her-2均為陰性，屬于三陰性乳腺癌細 胞株。該細胞株是目前研宄乳腺癌，特別是三陰性乳腺癌十分常用的一種細胞株。國內外 建立乳腺癌對阿霉素的耐藥細胞株已經很常用，而針對三陰性乳腺癌的耐藥細胞株仍較少 見，特別是由DDP(順鉑）誘導的三陰性乳腺癌耐藥細胞株未見報道。本發明是首次建立 MDA-MB-231細胞對DDP的耐藥細胞株，建立該細胞株能夠為腫瘤耐藥相關研宄提供必要的 研宄模型，具有實用價值。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題之一是提供一種三陰性乳腺癌順鉑耐藥細胞株 MDA-MB-231/DDP，為以下相關研宄提供耐藥腫瘤細胞模型：研宄耐藥腫瘤細胞形態學及生 物學特點、研宄腫瘤耐藥機制、分析化療藥物敏感性及篩選化療藥物、開發腫瘤耐藥逆轉藥 物、研發更有效的腫瘤治療方法等。目前國內外尚無MDA-MB-231細胞對DDP的耐藥株，我 們的發明為三陰性乳腺癌的研宄提供了一種重要的基礎研宄模型。
[0006] 本發明要解決的技術問題之二是提供該三陰性乳腺癌順鉑耐藥細胞株的制備方 法。
[0007] 本發明要解決的技術問題之三是提供該三陰性乳腺癌順鉑耐藥細胞株的用途。
[0008] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0009] 在本發明的一方面，提供一種三陰性乳腺癌順鉑耐藥細胞株，該細胞株命名為人 三陰性乳腺癌耐藥細胞株MDA-MB-231/DDP，已于2015年3月12日保藏在中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱為CGMCC)，保藏編號為CGMCCNo. 10406,保藏地點： 中國，北京。
[0010] 本發明通過細胞形態學觀察、生長曲線、細胞耐藥指數測定、基因芯片檢測、耐藥 相關基因檢測，評價三陰性乳腺癌順鉑耐藥細胞株MDA-MB-231/DDP的生物學特性，結果成 功建立了MDA-MB-231/DDP耐藥株，耐藥指數為11倍。
[0011] 在本發明的另一方面，提供該三陰性乳腺癌順鉑耐藥細胞株的制備方法，本發明 采用人三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231為誘導對象，采用逐步遞增DDP濃度，持續作用的 體外誘導法建立了人三陰性乳腺癌耐藥細胞株MDA-MB-231/DDP。
[0012] 具體地，本發明涉及的人三陰性乳腺癌順鉑耐藥細胞株MDA-MB-231/DDP是按照 如下方法建立獲得：
[0013] (1)人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞株，復蘇后用L15培養液（含10%胎牛血清、 青霉素100U/ml、鏈霉素100yg/ml)(優選于37°C、5%C02、95%濕度條件下）培養；
[0014] (2)取對數生長期MDA-MB-231細胞，換新鮮培養液，加入DDP，使其作用濃度為 100ng/ml，（優選在37°C、5%C02、95%濕度條件下）繼續培養，適時換液，維持100ng/ml藥 物濃度直至存活細胞能在此濃度穩定生長、傳代；
[0015] (3)適當增加DDP的作用濃度，（優選在37°C、5%C02、95%濕度條件下）繼續培 養，適時換液，維持藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩定生長、傳代；
[0016] (4)重復步驟（3)直到獲得能在4μg/mlDDP中穩定生長、傳代及復蘇的 MDA-MB-231/DDP細胞株。
[0017] 在誘導過程中，掌握適當的DDP增加濃度非常重要，理想狀況是既通過增加藥 物濃度篩選出少數耐藥細胞又不致于使全部細胞死亡，從而不斷獲得有更高耐藥性的 MDA-MB-231細胞。經過探索，在我們的發明中優選采用每階段增加200-500ng/mlDDP的方 法取得了較好效果，歷時7個月建立了MDA-MB-231/DDP耐藥細胞株。
[0018] 此外，在本發明的另一方面，還提供該三陰性乳腺癌順鉑耐藥細胞株在制備乳腺 癌耐藥逆轉藥物中的應用。
[0019] 與現有技術相比，本發明的有益效果在于：本發明可用于分析三陰性乳腺癌細胞 DDP耐藥后的形態學及生物學表型的變化；研宄腫瘤對DDP耐藥的分子機制和逆轉腫瘤耐 藥的方法及篩選其他抗腫瘤藥物；發現腫瘤耐藥標志物以及篩選和評估新型抗腫瘤藥物 等，具有較高的科研和生產應用價值。經實驗驗證，本發明三陰性乳腺癌順鉑耐藥細胞株MDA-MB-231/DDP的耐藥指數為11，具有較高的耐藥性，可用于制備乳腺癌耐藥逆轉藥物。
【附圖說明】
[0020] 圖1是本發明實施例2中倒置顯微鏡下MDA-MB-231細胞觀察圖（X200);
[0021] 圖2是本發明實施例2中倒置顯微鏡下MDA-MB-231/DDP細胞觀察圖（X200);
[0022] 圖3是本發明實施例2中MDA-MB-231和MDA-MB-231/DDP細胞內順鉑濃度檢測 圖；
[0023] 圖4是本發明實施例2中MTT法檢測順鉑作用MDA-MB-231細胞及MDA-MB-231/ DDP細胞72h的增殖抑制率示意圖；
[0024] 圖5是本發明實施例2中MDA-MB-231細胞和MDA-MB-231/DDP細胞中耐藥基因含 量圖（**P〈0. 01);
[0025] 圖6是本發明實施例2中MDA-MB-231細胞和MDA-MB-231/DDP細胞差異基因聚類 分析圖；
[0026] 圖7是本發明實施例2中MDA-MB-231/DDP細胞差異基因所調節的部分GOs;
[0027] 圖8是本發明實施例2中MDA-MB-231/DDP細胞差異基因所調節的信號通路 (P<0. 05)；
[0028] 圖9是本發明實施例2中MDA-MB-231/DDP細胞差異基因間相互作用網絡；
[0029] 代號為MDA-MB-231/DDP的人三陰性乳腺癌耐藥細胞株，已于2015年3月12日保 藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱為CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 10406,保藏地點：中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研宄所。
【具體實施方式】
[0030] 下面的實施例可以使本領域技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制 本發明。
[0031] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下