一種無血清人的外周血淋巴細胞培養基的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種生物制劑，尤其涉及一種淋巴細胞培養基。
【背景技術】
[0002] 隨著細胞遺傳學的發展，外周血淋巴細胞染色體核型分析已成為產前診斷的常規 檢測項目。淋巴細胞培養基作為此檢測項目的主要材料，其產品質量水平直接影響檢測的 成功率和準確性。常規的外周血淋巴細胞培養基是在基礎培養基（如RPMI1640)的基礎 上添加一定量的動物血清（如牛血清），作為提供細胞生長、增殖所必需的物質。但利用動 物血清的缺點也很明顯：由于血清成分復雜，不僅有促生長物質，還含有潛在的生長抑制物 質；且不同批次的血清存在的質量波動，造成培養基細胞培養效果的批間差異。
[0003] 本發明所要解決的技術問題在于現有外周血淋巴細胞培養基大多采用動物或人 的血清作為添加物，不僅成本較高，而且增加了傳播疾病的風險，同時不同批次間存在質量 差異的問題。
【發明內容】
[0004] 為了克服現有技術的缺陷，本發明提供一種優化的無血清組成的外周血淋巴細胞 培養基，用于染色體核型分析，具有成本低廉、質量穩定、培養效果佳的優點。
[0005] 本發明提供一種無血清人的外周血淋巴細胞培養基，包括凝集素、基礎培養基以 及血清替代物，所述凝集素為L型植物血球凝集素，所述基礎培養基為RPMI1640基礎培養 基，所述血清替代物包括牛血清白蛋白、重組人胰島素、檸檬酸鐵和氨基酸母液。
[0006] 優選地，本發明的無血清人的外周血淋巴細胞培養基，包括如下組分：RPMI1640 培養基干粉10. 4g/L，碳酸氫鈉2.Og/L，牛血清白蛋白4.Og/L，L型植物血球凝集素20mg/L，氨基酸母液20ml/L，檸檬酸鐵lmg/L，重組人胰島素10mg/L。
[0007] 優選地，本發明的無血清人的外周血淋巴細胞培養基，所述氨基酸母液包括L-谷 氨酸、L-甘氨酸和L-天冬氨酸。
[0008] 優選地，本發明的無血清人的外周血淋巴細胞培養基，氨基酸母液中L-谷氨酸的 濃度為300mg/L，L-甘氨酸的濃度為100mg/L，L-天冬氨酸的濃度為400mg/L。
[0009] 優選地，本發明的無血清人的外周血淋巴細胞培養基，所述牛血清白蛋白的純度 不低于98%。
[0010] 優選地，本發明的無血清人的外周血淋巴細胞培養基，所述L型植物血球凝集素 (PHA-L)為來自紅腰子豆的具有刺激T淋巴細胞有絲分裂的凝集素類糖蛋白組分。
[0011] 優選地，本發明的無血清人的外周血淋巴細胞培養基，所述L型植物血球凝集素 (PHA-L)的純度不小于95%。
[0012] 本案中所用的植物血球凝集素（Phytohemagglutinin，PHA)為存在于紅腰子豆 (Phaseolusvulgaris)的植物類凝集素。與由同種亞基組成的凝集素如ConA不同，PHA由 兩種不同亞基組成的凝集素。其亞基可以分為PHA-E和PHA-L兩類，其中PHA-E型亞基具 有較為顯著的凝集紅細胞功能而無淋巴細胞刺激活性，而PHA-L型亞基則具有較為顯著的 刺激淋巴細胞增殖的功能。
[0013] 優選地，本發明的無血清人的外周血淋巴細胞培養基，所述重組人胰島素是使用 酵母或大腸桿菌為工程菌生產出來的藥用級的胰島素。
[0014] 本發明專利申請中涉及的制劑除特殊說明均可以從市面購買，特此說明。
[0015] 本發明的無血清人的外周血淋巴細胞培養基采用血清替代物替代傳統使用的動 物或人血清，這樣可以不僅可以降低培養基成本，還可以降低傳播疾病的風險；本發明的 無血清人的外周血淋巴細胞培養基所用組分確定，避免了傳統血清成分復雜，不同批次間 具有質量差異，而導致培養效果波動的問題；本發明提供的細胞培養基淋巴細胞轉換率與 淋巴細胞分裂指數高，試劑成本低、質量穩定，培養的細胞可用于染色體核型分析的臨床診 斷。
【附圖說明】
[0016] 利用附圖對本發明作進一步的說明，但附圖中的內容不構成對本發明的任何限 制。
[0017] 圖1是PHA提取物和純化的PHA-L電泳檢測結果，其中1 :PHA粗制品；2 :PHA-L; 3 :蛋白分子Markers。
【具體實施方式】
[0018] 結合以下實施例對本發明作進一步描述。
[0019] 本發明提供一種無血清人的外周血淋巴細胞培養基，包括凝集素、基礎培養基以 及血清替代物，所述凝集素為L型植物血球凝集素，所述基礎培養基為RPMI1640基礎培養 基，所述血清替代物包括牛血清白蛋白、重組人胰島素、檸檬酸鐵和氨基酸母液。
[0020] 本發明的無血清人的外周血淋巴細胞培養基，所用牛血清白蛋白的純度不低于 98%。所用L型植物血球凝集素（PHA-L)為來自紅腰子豆的具有刺激T淋巴細胞有絲分裂 的凝集素類糖蛋白組分，純度不小于95%。所述重組人胰島素是使用酵母或大腸桿菌為工 程菌生產出來的藥用級的胰島素。
[0021] 實施例一
[0022] (一）50X氨基酸母液的配制
[0023] 所用L型氨基酸皆來自國藥集團（BR級），1L氨基酸母液具體配制如下：
[0024] 分別稱量L-谷氨酸300mg、L-甘氨酸100mg、L-天冬氨酸400mg，加入500mL超純 水中，攪拌均勻，加超純水定容至l〇〇〇mL，混勻后分裝，于4°C貯存備用。
[0025](二）PHA-L的制備方法
[0026] (1)PHA粗提物提取：
[0027]1?材料：紅腰子豆（新鮮，無發霉，色澤鮮明）。
[0028] 2.將檢驗合格的紅腰子豆粉碎，過100目篩網，制成紅腰子豆豆粉。取一定量的紅 腰子豆豆粉，用倍量的生理鹽水浸泡，置冰箱內浸泡12小時。將樣品離心（20°C、lOOOOrpm、 15min)，收集上清。將上清加乙醇至30%，置冰箱內12小時。離心，棄去上清，沉淀用4#漏 斗過濾，取沉淀置4°C冰箱12小時。沉淀中加入乙醇、乙醚，使溶液乙醇濃度達到70%，置 4°C冰箱12小時。棄去上清，沉淀離心，用乙醇洗滌，離心，取沉淀。樣品置-20°C冰箱預冷lh，凍干，樣品存于4°C冰箱保存，備用。
[0029] (2)PHA_L的純化：
[0030] 采用陰離子交換層析方法對PHA進行分離，方法如下：以15mmolNa2HP04(pH6. 5) 溶液平衡DEAE-