一種弱化hemB基因表達提高大腸桿菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種弱化hemB基因表達提高大腸桿菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法， 屬于代謝工程和微生物發酵領域。
【背景技術】
[0002] 5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinicacid,ALA)，分子式為C503NH9，分子量為 131. 13,恪點為149-151°C，它是生物體合成葉綠素、血紅素、維生素B12等關鍵前體物質。 ALA已廣泛應用于醫學和農業領域，作為一種安全、選擇、滲透性好的光動力學藥物已成功 應用于皮膚癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的診斷和光動力治療中。另外，由于ALA在自然界 中可降解，作為一種無公害的新型光活化農藥、除草劑以及植物生長調節劑等在農藥領域 應用也非常廣泛。
[0003] 目前，ALA主要通過化學法合成，最早出現在上世紀50年代，到20世紀90年代， 相關研宄開始大量開展并取得一定的成績。但化學合成存在許多缺點，如反應步驟繁瑣，副 產物多，分離提純困難，ALA得率也較低，并且環境污染嚴重。近年來，微生物發酵生產ALA 已成為研宄的熱點。自然界中，ALA的生物合成存在兩條途徑，一條是C4途徑，琥珀酰-CoA 和甘氨酸在5-氨基乙酰丙酸合成酶（ALAS，hemA編碼）作用下生成ALA的一步酶促反應， 主要存在于一些光合細菌、真菌以及動物體內。另外一條是廣泛存在于植物、藻類以及細菌 (如大腸桿菌）中的C5途徑，首先谷氨酸在谷氨酰-tRNA合成酶（GluRS，gltX編碼）催化 下，生成谷氨酰_tRNA，然后，谷氨酰-tRNA在谷氨酰-tRNA還原酶（GluTR，hemA編碼）作 用下生成谷氨酸-1-半醛（GSA)，最后GSA由谷氨酸-1-半醛-2, 1-氨基轉移酶（GSA-AT， hemL編碼）催化生成ALA。
[0004] 早期，人們篩選到產ALA的光合細菌類球紅細菌（Rhodobactersphaeroides)， 通過誘變育種篩選ALA的高產菌株，并通過發酵優化等方法使得ALA的產量達到7. 2g/L。 但由于光合細菌的特殊性，其成本較高，不適合大規模的工業化生產。隨著基因工程技術 的成熟，Mariet和Zeikus選用大腸桿菌作為宿主細胞，采用基因工程的技術表達來源于 R.sphaeroides的ALA合酶基因（hemA)，ALA產量為3. 79g/L。Xieetal.等利用過量表達 R.sphaeroides來源的hemA基因，經發酵優化，ALA產量最高達到5. 2g/L。但目前以Oi途 徑為基礎的生物轉化由于添加前體琥珀酸和甘氨酸生產ALA成本相對較高，Kangetal.等 通過分析大腸桿菌中C5途徑的調控機制，發現ALA合成C5途徑的關鍵基因hemA和hemL， 同時實現了以葡萄糖為唯一碳源發酵生產ALA。
[0005] 由于ALA是血紅素合成途徑的關鍵前體物質（圖1)，而血紅素是細胞生長所必需 的，為了進一步促進ALA的積累，本發明在表達5-氨基乙酰丙酸C5合成途徑關鍵酶基因 hemL和hemA和表達來源于大腸桿菌血紅素生物合成途徑基因hemD及hemF的基礎上，通過 在基因組水平改造ALA下游5-氨基乙酰丙酸脫水酶編碼基因hemB的啟動子，弱化hemB基 因的表達水平，實現ALA產量的進一步提高。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是提供一種提高大腸桿菌工程菌株產5-氨基乙酰丙酸 的方法，是在基因組水平削弱大腸桿菌工程菌株hemB基因的表達，實現ALA產量的進一步 提尚。
[0007] 所述在基因組水平削弱hemB基因的表達，是在基因組水平將hemB基因的啟動子 替換為在大腸桿菌生長穩定期強度減弱的啟動子，例如基因fliC、flgC、tnaA、tap或fliA 的啟動子。
[0008] 在本發明的一種實施方式中，所述在大腸桿菌生長穩定期強度減弱的啟動子是 flic基因的啟動子，來源于大腸桿菌，序列如SEQIDNO. 5所示。
[0009] 在本發明的一種實施方式中，所述大腸桿菌工程菌株，是以大腸桿菌為宿主，使用 不同拷貝數的表達載體組合過量表達谷氨酰-tRNA還原酶（hemA編碼）、谷氨醛氨基轉移酶 (hemL編碼）、尿卟啉原III合酶（hemD編碼）和糞卟啉原III氧化酶（hemF編碼）。
[0010] 在本發明的一種實施方式中，所述大腸桿菌是EscherichiacoliBL21 (DE3);所 述不同拷貝數表達載體分別為pRSFDuet-1和pETDuet-l〇
[0011] 在本發明的一種實施方式中，所述hemL的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0012] 在本發明的一種實施方式中，所述hemA的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0013] 在本發明的一種實施方式中，所述hemD的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。
[0014] 在本發明的一種實施方式中，所述hemF的核苷酸序列如SEQIDNO. 4所示。
[0015] 在本發明的一種實施方式中，所述大腸桿菌工程菌株以pRSFDuet-1串聯表達 hemA、hemL、hemF，并以pETDuet-1表達hemD〇
[0016] 本發明還提供了一種5-氨基乙酰丙酸產量提高的重組大腸桿菌，是將 大腸桿菌基因組中hemB基因的啟動子替換為fliC基因的啟動子，并轉入質粒 pRSFDuet-1-hemA-hemL-hemF和pETDuet-1-hemDo
[0017] 所述重組大腸桿菌的構建方法，是通過基因重組將大腸桿菌基因組上的hemB 基因的啟動子替換為fliC基因的啟動子，然后將質粒pRSFDuet-1-hemA-hemL-hemF 和pETDuet-1-hemD轉化改造的菌株E.coliBL21(DE3)PfliC中，構建重組工程菌株 PfliC-LADF-6 :E.coliBL21(DE3)PfliC/pRSFDuet-l-hemA-hemL-hemFpETDuet-l-hemD〇
[0018] 應用所述重組大腸桿菌生產5-氨基乙酰丙酸時，可將菌株活化后，以2%接種 量轉接發酵培養基中發酵，〇h時添加0. 1-0. 5mMIPTG誘導基因表達以及氨芐青霉素 (100yg/mL)和卡那霉素（50yg/mL)，30-37°C，200r/min培養，周期 28-36h。
[0019] 本發明以表達C5途徑關鍵基因hemL和hemA以及ALA代謝途徑的下游基因hemD 和hemF的工程菌為出發菌株，通過在基因組水平改造hemB基因的啟動子，所得大腸桿菌工 程菌株在3L發酵罐中積累5-氨基乙酰丙酸4. 08g/L，有效地利用C5途徑促進5-氨基乙酰 丙酸的合成，實現了ALA產量的進一步提高。
【附圖說明】
[0020] 圖1 :大腸桿菌中血紅素合成途徑。
[0021] 圖2 :基因組改造hemB啟動子菌落PCR電泳圖。M:DL5000Maker;A:對照；B:改 造hemB啟動子菌株；C:改造hemB啟動子菌株。
[0022] 圖3 :改造hemB啟動子對重組大腸桿菌合成ALA的影響。（a) 250mL搖瓶發酵結 果；A:LADF-6;B:PfliC-LADF-6。（b)重組大腸桿菌在3L發酵罐發酵結果。
【具體實施方式】
[0023] ALA分析方法：
[0024] 采用Mauzerall和Granick的分光光度法：將樣品稀釋至2mL，加入lmL的乙酸鈉 緩沖液，〇. 5mL的乙酰丙酮，然后煮沸15min。冷卻至室溫，取2mL的反應液至新管中，然后 加入2mL的ModifiedEhrlich's試劑，反應20min，利用分光光度計554nm下檢測。
[0025]培養基：
[0026] 斜面培養基（g/L):蛋白胨10,氯化鈉10,酵母粉5. 0,瓊脂20,pH7. 0 ;
[0027] 種子培養基（g/L):蛋白胨10,氯化鈉10,酵母粉5. 0,pH7. 0,裝液量 20mL/250mL；
[0028]發酵培養基（g/L) : (NH4)2S0415,KH2P045. 0,Na2HP04 ? 12H20 15,MgS04 ? 7H20 1. 0， 酵母提取物1. 〇,葡萄糖20,pH7. 0。
[0029] 培養條件：
[0030] 菌種培養：甘油管劃線，然后挑取單菌落劃線平板37°C培養，作為種子來源；
[0031] 種子培養：平板挑取菌體，37°C，200r/min，根據要求添加氨芐青霉素100yg/mL， 卡那霉素50yg/mL，培養約12h，轉接發酵培養基；