一種海洋嗜瓊膠菌及其制法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物技術領域，具體地說是一種海洋嗜瓊膠菌及其制法和應用。
【背景技術】
[0002]海洋藻類有巨大的生物量，據統計，2012年全球水生藻類養殖量為2378萬噸。盡管海藻儲量及產量巨大，但是人們對其利用的方式和開發程度有限，目前海藻的應用還多停留于初級產品的制備，對其高值化和規模化的應用亟待探索，主要研發方向為海藻寡糖的制備和生物質能源轉化。在海藻的利用過程中，微生物降解的優勢日益凸顯，目前的海藻降解微生物資源已難以滿足海藻高值化和規模化開發的需求，具有優良特性的微生物菌株及海藻降解酶成為產業發展的關鍵要素。紅藻是主要的海水養殖藻類，其細胞壁中分別含有大量的瓊膠，具有巨大的開發潛力。
[0003]海藻是海洋植物的主體，是人類社會的一大自然財富。海洋中的海藻類植物約一萬多種，有綠藻門、褐藻門、藍藻門、紅藻門等11個門，目前有100多種多細胞藻可用作食品，如褐藻中的海帶、裙帶菜、巨藻；綠藻中的苔條、石莼；紅藻中的紫菜、石花菜等。瓊膠主要存在于海洋紅藻的細胞壁中，從石花菜、江蘺、紫菜中提取的瓊膠，廣泛用于食品生產，并在實驗室中作為培養基的凝固劑。
[0004]瓊膠酶的應用領域之一是用于紅藻和褐藻原生質體的制備，作為高效、可靠的海藻解壁酶。另外，低聚糖由于具有抗炎、抗病毒、調節免疫等多種功能而備受關注，因此研宄者們也開展了瓊膠降解制備低聚糖的研宄。其中酶法降解具備作用條件溫和，環保等優勢，是人們的研宄熱點。
[0005]由于目前瓊膠降解酶活性、表達量和穩定性等未達到工業化的要求，造成生產成本過高，到目前為止，這些瓊膠降解酶并未廣泛應用于工業化生產當中。因此，篩選新的瓊膠降解菌，可以為以上問題的解決提供豐富的菌種資源和酶資源。
【發明內容】
[0006]本發明針對現有技術的缺點和不足，提出了一種海洋嗜瓊膠菌及其制法和應用。
[0007]—種海洋嗜瓊膠菌，保藏名稱為榮成海洋嗜瓊膠菌Marinoagarivoransrongchengensis，于2015年03月31日由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏編號為CMCC N0.10676。保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號。
[0008]本發明所述海洋嗜瓊膠菌為革蘭氏陰性菌，氧化酶反應呈陽性，過氧化氫酶反應呈陰性，呼吸醌類型主要為泛醌Q8，細胞壁極性脂成分主要為磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰甘油(PG)和胺脂質(AL)。能夠降解瓊脂，產生瓊膠酶，還具有淀粉酶、脂酶和纖維素酶活性。
[0009]本發明還提出上述海洋嗜瓊膠菌的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
步驟1:海洋藻類樣品采集于山東省威海市榮成市沿海海岸，新鮮的藻類樣品被放置于無菌空離心管(80 mL)中密封保存，放置于帶冰袋的泡沫保溫箱中以保持藻類表面微生物的多樣性；
步驟2:從離心管中取出紅藻石花菜，稱取1g藻類樣品，用滅菌過的無菌海水沖洗藻類樣品表面3次，然后將沖洗過后的藻類放置于250 mL錐形瓶中(含100 mL無菌海水)，劇烈震蕩；
步驟3:另取沖洗過后的藻類樣品，對樣品充分研磨，稱取研磨后的紅藻石花菜10g，同樣置于250 mL錐形瓶中(含100 mL無菌海水)，劇烈震蕩；
步驟4:分別取錐形瓶中的上清液I mL，加入含9 mL無菌海水的試管中，做梯度稀釋，稀釋梯度為 10' 10_2，10_3，10_4，10_5;
步驟5:取原液及各稀釋梯度稀釋液100 μ L涂布于海洋瓊脂培養基2216Ε平板上，培養基由陳海水配制，蛋白胨5g/L，酵母粉lg/L，瓊脂18-20g/L，pH 7.0-7.6，每組做六個平行；
步驟6:將其中每組的三個平行放置于28°C恒溫培養箱中培養，每組的另外三個平行放置于37°C恒溫培養箱中培養，培養時間為72h ；
步驟7:對培養后的平板做目測觀察，目標菌落是能夠降解瓊脂形成平板凹陷的菌群，輔助檢測為滴加盧氏碘液觀察菌落周圍是否有透明圈存在(瓊膠降解菌能降解菌落周圍的瓊膠，使盧氏碘液無法著色，從而形成透明圈);
步驟8:將篩選到的目標菌落轉接純化三次，獲得目標菌株。
[0010]本發明還提出了如上所述海洋嗜瓊膠菌用于海藻降解的方法，其特征在于包括以下步驟:
步驟1:種子液制備，挑取海洋嗜瓊膠菌單菌落至于含有0.2%瓊脂的2216E培養基中，28。。，150 rpm 培養 12 小時；
步驟2:海藻培養基制備，將石花菜等海藻洗凈，剪碎，按照重量體積比10%比例添加至2216E液體培養基中，滅菌處理；
步驟3:將海洋嗜瓊膠菌Zl按照1-2%比例接種至海藻培養基中，280C，150 rpm培養72小時，可以完全液化石花菜，達到該類海藻的降解。
[0011]本發明進一步提出了如上所述海洋嗜瓊膠菌用于海藻寡糖制備的方法，其特征在于包括以下步驟:
步驟1:種子液制備，挑取海洋嗜瓊膠菌單菌落至于含有0.2%瓊脂的2216E培養基中，28。。，150 rpm 培養 12 小時；
步驟2:擴大培養，將種子液按照1%_2%接種量接種至新的0.2%瓊脂的2216E培養基中，28。。，150 rpm培養72小時;
步驟3:粗酶液的獲取，將擴大培養的菌液離心(4°C、1000 rpm、離心1min)收集發酵上清液，并用0.2微米濾膜過濾除菌，冷凍真空干燥，備用；
步驟4:瓊脂糖底物的制備，將瓊脂糖3g添加至IL去離子水中，加熱至100°C，期間不斷攪拌混勻，冷卻至30°C _40°C備用；
步驟5:瓊膠粗寡糖的制備，將發酵上清液按照10%比例添加凍干的粗酶液，并置于37°C溫浴72h-96h，并用磁力攪拌器攪拌，獲得粗寡糖。
[0012]本發明菌株應用于工業生產時，相對于現有技術具有以下優勢:本菌株瓊膠降解效率高，生長迅速、且生長溫度范圍較寬，具有較高的工業應用潛力。
[0013]【附圖說明】:
附圖1是本發明中菌株Zl的16S rDNA序列及完整的16S rDNA序列Neighbour-joining (NJ)發育樹。
[0014]附圖2是本發明中海洋嗜瓊膠菌瓊膠降解范例圖。
[0015]【具體實施方式】:
下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0016]如附圖1所示，本發明提出了一種海洋嗜瓊膠菌，保藏名稱為榮成海洋嗜瓊膠菌Marinoagarivorans rongchengensis，于2015年03月31日由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏編號為CMCC N0.10676。
[0017]本發明所述海洋嗜瓊膠菌為革蘭氏陰性菌，氧化酶反應呈陽性，過氧化氫酶反應呈陰性，呼吸醌類型主要為泛醌Q8，細胞壁極性脂成分主要為磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰甘油(PG)和胺脂質(AL)。能夠降解瓊脂，產生瓊膠酶，還具有淀粉酶、脂酶和纖維素酶活性。
[0018]本發明所述海洋嗜瓊膠菌的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
步驟1:海洋藻類樣品采集于山東省威海市榮成市沿海海岸，新鮮的藻類樣品被放置于無菌空離心管(80 mL)中密封保存，放置于帶冰袋的泡沫保溫箱中以保持藻類表面微生物的多樣性；
步驟2:從離心管中取出紅藻石花菜，稱取1g藻類樣品，用滅菌過的無菌海水沖洗藻類樣品表面3次，然后將沖洗過后的藻類放置于250 mL錐形瓶中(含100 mL無菌海水)，劇烈震蕩；
步驟3:另取沖洗過后的藻類樣品，對樣品充分研磨，稱取研磨后