銅綠假單胞菌株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物的開發和應用領域，具體地說涉及一種銅綠假單胞菌株及其應 用。
【背景技術】
[0002] 生物表面活性劑（Biosurfactants)是微生物在代謝過程中分泌的具有表面活 性，同時含有親水基和疏水基的兩性化合物，包括糖脂、脂肽、脂蛋白、磷脂以及中性類脂衍 生物等。與化學合成的表面活性劑相比，生物表面活性劑有許多明顯的優勢：（1)低臨界膠 束濃度和高表界面活性；（2)對離子強度的穩定性；（3)較高的生物降解性和低毒性；(4) 逐步吸附和持久的活性；（5)優良的破乳性能。目前，石油污染是世界各國面臨的一個突出 的環境難題，各國都在研宄如何運用生物修復技術進行石油污染土壤的修復，而生物表面 活性劑的應用是生物修復的一個關鍵因素。
[0003] 但是目前合成生物表面活性劑的主要問題在于產量過低，提取純化費用過高，生 物表面活性劑的成本比化學表面活性劑的成本高3 -10倍。因此降低生產成本、選育生物 表面活性劑的高產菌株、優化發酵培養條件以及開發經濟有效的回收工藝，是目前研宄的 重點。
【發明內容】
[0004] 本發明所要解決的技術問題是提供一種能夠合成得到高產量、高質量的糖脂類生 物表面活性劑的銅綠假單胞菌株。
[0005] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種從遼寧省盤錦市遼河某油田受污染土壤 中篩選出的銅綠假單胞菌株，該菌株的保藏號為：CCTCCM2015272,保藏日期為2015年5 月4日，中文名（拉丁文學名）為銅綠假單胞菌株（Pseudomonasaeruginosa)，保藏單位為 中國典型培養物保藏中心，地址中國武漢大學校內。
[0006] 本發明還提供銅綠假單胞菌株CCTCCM2015272在合成糖脂類生物表面活性劑中 的應用。
[0007] 本發明還提供利用銅綠假單胞菌株CCTCCM2015272合成糖脂類生物表面活性劑 的方法，包括以下步驟：將保藏號為CCTCC M 2015272的銅綠假單胞菌株接種至種子培養 基中，于30-35°C、120-150r/min的發酵條件下恒溫振蕩培養1-2天，然后以5-10%的 接種量接種于發酵培養基中，于相同的發酵條件下恒溫振蕩培養5- 7天，最后通過沉淀法 或溶劑萃取法從發酵液中提取出糖脂類生物表面活性劑；
[0008] 所述種子培養基為牛肉膏液體培養基，所述發酵培養基為葡萄糖液體培養基。
[0009] 進一步的，所述牛肉膏液體培養基的組成為：每1000毫升水中含有3.0克牛肉膏、 1. 0 克NaN03、l. 0 克（NH4)2S04、1. 2 克Na2HP04 ? 12H20、1. 0 克KH2P04、0. 01 克MgS04 ? 7H20 和 0? 002 克CaCl2;
[0010] 所述葡萄糖液體培養基的組成為：每5毫升微量元素溶液中含有35. 0克葡萄糖、 4. 0 克NaN03、1. 1 克KC1、4. 0 克NaCl、0. 028 克FeS04.7H20、1. 5 克KH2P04、1. 5 克K2HP04、0. 5 克MgS04 ? 7H20和0. 5克酵母粉；
[0011] 其中微量元素溶液的組成為：每1000毫升水中含有〇. 029克ZnS04、0. 024克 CaCl2、0. 025 克CuS04和 0? 017 克MgSO4。
[0012] 上述配方的培養基能夠為銅綠假單胞菌株CCTCCM2015272提供良好的生長營養 和環境，有利于降低合成周期，并提高糖脂類生物表面活性劑的產量。
[0013] 本發明的有益效果為：
[0014] 1.本發明銅綠假單胞菌株CCTCCM2015272能夠用于合成糖脂類生物表面活性劑， 并且本發明銅綠假單胞菌株CCTCCM2015272的糖脂類生物表面活性劑的產量遠遠高于現 有銅綠假單胞菌株的糖脂類生物表面活性劑的產量；
[0015] 2.本發明銅綠假單胞菌株CCTCCM2015272合成所得的糖脂類生物表面活性劑相 比于現有銅綠假單胞菌株合成所得的糖脂類生物表面活性劑，其對溫度的耐受性更強，并 且對pH有更廣泛的適應性。
[0016] 3.本發明提供的利用銅綠假單胞菌株CCTCCM2015272合成糖脂類生物表面活性 劑的方法工藝簡單、周期短、易于實施，適用于工業化大規模生產。
【附圖說明】
[0017]圖1是本發明實施例1篩選所得菌株的系統發育樹圖。
[0018] 圖2是銅綠假單胞菌株CCTCCM2015272合成所得的生物表面活性劑的紅外吸收光 譜圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合附圖、實施例對本發明作進一步描述：
[0020] 實施例1
[0021] 銅綠假單胞菌株的篩選及鑒定，包括以下步驟：
[0022] 實驗材料：
[0023]富集培養基：NaCl3. 0g，NH4C1 0?lg，MgS04 ? 7H20 0? 02g，NaN030. 2g，KH2P040.lg， K2HP040. 2g，原油 3. 0g，蒸餾水 1000mL。
[0024]油平板培養基：蛋白胨 5. 0g，NaCl3. 0g，NH4C1 0?lg，MgS04 ? 7H20 0? 02g， NaN030 . 2g，KH2P040.lg，K2HP040. 2g，瓊脂20. 0g。滅菌后倒平板，在其表面涂布一層經石油 醚稀釋的原油。
[0025]種子培養基：牛肉膏 3. 0g，NaN03l. 0g，（NH4)2S041. 0g，Na2HP04 ? 12H20 1. 2g， KH2P041. 0g，MgS04 ? 7H20 0? 01g，CaCl20. 002g，蒸餾水 1000mL〇
[0026]發酵培養基：葡萄糖 35. 0g，NaN034. 0g，KC1 1.lg，NaCl4. 0g，FeS04 ? 7H20 0? 028g，KH2P041. 5g，K2HP041. 5g，MgS04 ? 7H20 0? 5g，酵母粉 0? 5g，微量元素溶液 5mL。
[0027]微量元素溶液：ZnS040 . 0 29g，CaCl20. 024g，CuS040. 025g，MgS040. 017g，蒸餾水 lOOOrnL。
[0028]1. 1初篩
[0029] 稱取土樣（采集于遼寧省盤錦市遼河某油田受污染土壤）10g，加入90mL無菌水， 150r/min搖床振蕩2h，靜置30min后取上清液lOmL接種到裝有90mL富集培養基的搖瓶 中，于30°C、120r/min的恒溫搖床中振蕩培養，3d后取培養液轉接至富集培養基中，在同樣 條件下進行二次培養。取二次培養的培養液lmL，用無菌水進行梯度稀釋，取不同濃度梯度 的富集培養液涂布于油平板培養基，于30°C培養箱中培養24h后挑取有較大排油圈的單菌 落，進一步分離純化，得到初篩菌株。
[0030] 1. 2復篩
[0031] 將初篩菌株接種至種子培養基中，于30°C、120r/min恒溫搖床中振蕩培養ld，然 后以5%的接種量接種于發酵培養基中，于同樣條件下培養3d。取一加有20mL水的培養皿， 在水面上加O.lmL石蠟油（加適量蘇丹紅染色）形成紅色油膜，在油膜中心滴入搖瓶發酵 液，測量排油圈直徑大小，直徑大于3cm的菌株保留做進一步研宄。同時，測定發酵液的表 面張力，篩選出產生物表面活性劑的優勢菌種。
[0032] 1.3表面張力測定
[0033] 將發酵液過濾除油，12000r/min離心20min，取上清液，采用Auto-tensiometer QBZY-1表界面張力儀鉑金板法測定表面張力。
[0034] L4菌株鑒定
[0035] 由上海生物工程技術服務有限公司對上述篩選得到的菌株進行16S rRNA測序，將 所測序列在GenBank核酸序列數據庫中與已有的其他16S rRNA序列數據進行相似性分析。
[0036] 采用DNA快速提取試劑盒提取降解菌的基因組作為模板，進行16SrRNA基因的 擴增，將PCR擴增產物進行1 %的瓊脂糖凝膠電泳后，進行16SrRNA測序，將所測序列在 GenBank核酸序列數據庫中與已有的其他16SrRNA序列數據進行相似性分析。參見圖1， 用1