一株枯草芽孢桿菌及其代謝產物與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株枯草芽孢桿菌及其代謝產物與應用，尤其是涉及一株具有除草活 性的枯草芽孢桿菌及其代謝產物大豆蛋白發酵液與應用，屬于天然植物材料用于農業植物 保護、防除農作物雜草的技術領域。
【背景技術】
[0002] 目前，種植業中對有害生物的生物防治主要針對植物病害和害蟲危害，而對雜草 的生物防治方法應用較少。
[0003] 雜草危害是影響農業生產的主要問題之一，多年來的應對方法以化學防治為主， 而隨著化學除草劑的長期和過度使用，其帶來的環境問題和對農作物品質的影響已經日益 受到關注，尋求天然的植物源除草劑是解決這一問題的有效途徑。相關研宄表明，農田和園 林生態系統中存在多種植物間的生化他感作用，某些植物殘體的分解產物也能抑制植物種 子萌發和生長，利用植物間的生化他感作用控制雜草是當前雜草防治研宄的熱點。
[0004] 稗草是一種一年生草本植物，一般長在稻田里、沼澤、溝渠旁、低洼荒地，生長在稻 田時，它長在稻子和稻子的間隙里，和稻子一起爭養分，爭空間，稗子和稻子外形極為相似， 難以與稻子區分，因此稗子屬于惡性雜草。
[0005] 20世紀90年代初，美國Christians等發現了玉米蛋白粉對植物種子萌發時生 根的抑制作用，并將其作為無公害植物源除草劑應用在草坪和有機農業的雜草防治上；用 堿性蛋白酶水解玉米蛋白粉制備的水解多肽比玉米蛋白粉具有更高的生根抑制活性，Liu 等從玉米蛋白粉水解物中分離出了高除草活性的多肽。之后更多相關研宄表明，包括大豆 蛋白在內的多種天然蛋白材料的水解產物同樣具有除草活性。目前國內外的相關研宄中， 雖然使用蛋白酶水解蛋白材料能提高其對雜草的抑制活性，但蛋白酶的酶促水解反應對溫 度、pH等條件要求相對嚴格，在不良條件下存在蛋白酶易失活的問題，另外使用蛋白酶還存 在成本過高的問題。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是，克服現有技術的不足，提供一株枯草芽孢桿菌及其 代謝產物與應用，利用枯草芽孢桿菌對大豆蛋白進行純菌株發酵，從而提供一種具有除草 活性的大豆蛋白發酵液，成本較低。
[0007] 本發明解決其技術問題采用的技術方案是： 本發明之枯草芽孢桿菌，是枯草芽孢桿菌L-5 L-5)，該菌種于 2015年02月02日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址： 北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研宄所）保藏，菌種保藏號為CGMCC No: 10505。
[0008] 本發明中所述枯草芽孢桿菌L-5是通過以下方法分離得到的： (1)分離純化：稱取5. 0g醬油渣(醬油渣采集自湖南長沙本地醬油廠)，加入100毫升 無菌生理鹽水中，震蕩2小時后再用生理鹽水梯度稀釋；取稀釋倍數105~108的菌液各100 微升，將其分別均勻涂布于LB固體培養基上，37°C倒置培養24小時，每個稀釋度各兩個重 復；挑取不同菌落形態的菌株進行反復劃線純化，直至菌落形態一致和顯微鏡鏡檢特征相 同； (2) 菌株的篩選：挑取已純化的菌株置于脫脂奶粉瓊脂培養基37°C培養，挑取有明顯 水解圈的菌落進行單獨培養，并觀測其在脫脂奶粉瓊脂培養基上培養3天的降解透明圈大 小，選取一株獲得最大降解透明圈（透明圈直徑達12毫米）的菌株，命名為L-5; (3) 菌株的鑒定：對菌株L-5進行形態、生理、生化特征的測定，并進行16SrDNA測序 分析；16SrDNA同源性分析表明，菌株L-5最接近于枯草芽孢桿菌達 到100%，結合菌株L-5形態學特征與生理生化實驗結果，將菌株L-5鑒定為枯草芽孢桿菌 即為枯草芽抱桿菌L-5。
[0009] 所述菌株L-5的特征：菌株L-5在LB固體培養基上形成的菌落表面粗糙，多褶皺， 不易挑起；呈不透明乳白色；菌體桿狀，革蘭氏染色為陽性；無莢膜、周生鞭毛。菌株L-5明 膠液化、淀粉水解、M.R、V.P、接觸酶、氧化酶、硝酸鹽還原實驗均表現為陽性，吲哚、硫化氫、 厭氧生長實驗均表現為陰性。16SrDNA同源性分析表明，菌株L-5最接近于枯草芽孢桿菌 (ifeciByssyki/is)，達到100%，結合菌株L-5形態學特征與生理生化實驗結果，將菌株 L-5鑒定為枯草芽孢桿菌
[0010] 本發明之枯草芽孢桿菌的代謝產物，即利用枯草芽孢桿菌作為發酵劑，其制備方 法，具體包括以下實施步驟： (1) 將菌株枯草芽孢桿菌L-5在LB固體培養基上培養12-24小時，接種于 100mL/250ml種子培養基中，種子培養基配方為胰蛋白胨8-12克、酵母提取物3-5克、NaCl 8-12克、蒸餾水900-1100毫升，pH值6. 8-7. 2, 121°C滅菌20-30分鐘，接種后于30°C下培 養12-18小時至對數期； (2) 取對數期菌株種子液接種于發酵培養基中，接種量4wt%，發酵培養基配方為：大 豆分離蛋白粉18-22克、NaC18-12克、蒸餾水900-1100毫升，pH值6. 8-7. 2,121 °C滅菌 20-30分鐘，冷卻后接種，然后在30°C、140-160rpm條件下震蕩培養72 - 120小時，培養 完成后用紗布過濾即獲得大豆蛋白發酵液。
[0011] 本發明之枯草芽孢桿菌代謝產物的應用，即枯草芽孢桿菌L-5的大豆蛋白發酵 液，用于防除水田雜草。其大豆分離蛋白粉的發酵液對初萌稗草具有明顯生根抑制作用。發 酵72小時的大豆蛋白發酵液，在每升溶液含2. 0克大豆蛋白發酵液的濃度下，對初萌稗草 抑制率達到94. 8%，田間每畝施用質量濃度2. 0克每升的溶液1. 5-3升，對稗草的防治效果 達89. 6%以上。
[0012] 本發明的有益效果是： 本發明利用純菌株發酵方法，制備具有除草活性的大豆蛋白發酵液，能提供一種制備 天然生物除草劑的方法，制備出的發酵液安全，環保，不產生毒副作用，具有重要生態意義。
[0013] 本發明使用枯草芽孢桿菌L-5對大豆分離蛋白進行發酵，發酵液對稗草尤其是初 萌稗草的生根具有明顯抑制活性；發酵液對已成熟的作物根系則沒有影響，而且，使用降解 菌對大豆分離蛋白的發酵條件相對簡單，常溫條件下即可進行。另外，相對于蛋白酶，使用 菌株發酵，成本較為低廉。因此，本發明利用枯草芽孢桿菌L-5發酵大豆分離蛋白來除草， 相對于使用蛋白酶進行水解，工藝更為簡單，成本更為低廉，更適宜大規模實際應用。
[0014] 大豆蛋白是一種天然植物材料，幾乎不產生任何環境污染，來源豐富且含氮量高， 是農作物有機肥來源之一，因此，利用本發明，可以將其作為天然的植物源除草劑且可以和 有機肥結合，應用于農業雜草防治。
[0015] 因此，利用大豆蛋白發酵液作為天然除草劑應用于雜草防治，特別適用于水稻田 中稗草的防治，可以減少化學除草劑的環境污染，改善有機種植產業，具有良好的經濟，生 態和社會效益，前景廣闊。
【附圖說明】
[0016] 圖1為0. 5mg/mL濃度下不同發酵時間所得大豆蛋白發酵液對稗草的根抑制活性 影響圖。
[0017] 微生物保藏情況說明 枯草芽孢桿菌L-5很L-5)，該菌種于2015年02月02日在中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號 院3號中國科學院微生物研宄所）保藏，菌種保藏號為CGMCCNo:10505。
【具體實施方式】
[0018] 以下結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0019] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制