一種源于象草的內生鞘氨醇單胞菌及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種源于象草的內生鞘氨醇單胞菌及其用途，具體涉及一種促進雜交 狼尾草生長發育功能的植物內生菌鞘氨醇單胞菌的分離、培養方法和用于促進雜交狼尾草 苗生長的用途，屬于農業應用微生物技術領域。
[0002]
【背景技術】： 象草schum)及雜交狼尾草作為禾本科多年生Oi草本植物， 是熱帶和亞熱帶地區廣泛栽培的一種優質、高產、用途廣泛的牧草。近年來，以其生物量大， 再生能力強，纖維素、半纖維素含量高，生態適應性強，適應性廣及利用年限長等特性，是能 源作物的首選資源之一。我國具有大面積的宜能邊際性土地，據預測，我國邊際性土地的生 物質生產潛力超過2億噸標準煤。因此，在宜能邊際性土地種植象草等能源草，開發生物質 能源，符合我國"不與糧爭地，不與人爭糧"的能源發展目標。但是這些區域生產條件較差， 缺乏灌溉保障，鹽堿危害嚴重，影響象草、雜交狼尾草的產量。
[0003]植物促生內生菌（Plant Growth-Promoting bacteria endophyte, PGPE)是指一 類能夠定殖在植物體內，并與植物體形成特異的共生關系，并因此對雙方都有益處的細菌。 它對提高土壤中營養物質的利用率、增強植物對逆境的適應性及耐受性，促進植物的生長 發育有重要作用，成為可持續性農業的重要發展方向。植物促生內生菌可以通過固氮作用、 分泌植物生長調節物質、合成鐵載體及抑制一些疾病的發生等方式促進植物的生長。
[0004] 雖然現在已經篩選到多種促生長作用的植物內生細菌，主要是來自水稻，玉米， 小麥，甘庶，蘋果，柑橘，高叢藍莓，桑葚，杏，它們在正常或脅迫條件下能促進植物健康生 長，提高其產量（（1) Kloepper, J.W. 1"4. Plant growth promoting bacteria (other systems) . In: Okon, J. (Ed. ), Azospirillum/Plant Association. CRC Press, Boca Raton, pp. 137 - 154. ； (2) De Silva, A. , Petterson, K. , Rothrock, C. , Moore, J. Growth promotion of high bush blue berry by fungal and bacterial inoculants. 2000. HortScience 35, 1228 - 1230. ； (3) Sudhakar, P. , Chattopadhyay, G. N., Gangwar, S. K. , Ghosh, J. K. Effect of foliar application of Azotobacter, Azospirillum and Beijerinckia on leaf yield and quality of mulberry (Morus alba), 2000, J. Agric. Sci. 134, 227 - 234. ； (4) Esitken, A., Karlidag, H., Ercisli, S. , Sahin, F. Effects of foliar application of Bacillus substilis Osu-142 on the yield, growth and control of shot-hole disease (Coryneum blight) of apricot, 2002, Gartenbauwissenschaft 67, 139 - 142. ；(5)Esitken, A., Karlidag, H. , Ercisli, S., Turan, M. , Sahin, F. The effect of spraying a growth promoting bacterium on the yield, growth and nutrient element composition of leaves of apricotCPrunus armeniaca L. cv. Hacihaliloglu), 2003, Aus. J. Agric. Res. 54，377 - 380)。但是沒有專門來源于象草的促生內生菌，本發明提供的來源于象草 的優良促生內生菌鞘氨醇單胞菌，為更有效地增強象草、雜交狼尾草的抗逆性、提高其在沿 海灘涂、鹽堿地、貧瘠地等邊際性土地的產量提供保障。
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【發明內容】
： 本發明的目的在于提供一種來源于象草的鞘氨醇單胞菌，該菌株能在植物內定殖，并 具有分泌IAA、固氮、產鐵載體等促生性能，可用于促進鹽脅迫下的雜交狼尾草苗生長，有助 于促進象草及雜交狼尾草作為能源草在在鹽堿性邊際土地上的種植。
[0006] 為了實現以上目的，本發明提供的技術方案是： 所述的來源于象草的鞘氨醇單胞菌是從象草植株中分離到的一株內生菌，經傳統方法 鑒定和分子鑒定表明它屬于鞘氨醇單胞菌，將其命名為鞘氨醇單胞菌PP〇l (從 sp. ppOl)，于2014年7月4號在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC) 保藏，保藏地址為中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研宄所，保藏號 CGMCC 9414。
[0007] 本發明的象草內生菌鞘氨醇單胞菌ppOl，是按如下方法從象草中分離培養得到 的： (1) 取自江蘇省農科院試驗田的象草蘇牧2號，取根部經表面消毒殺滅供試材料表 面微生物，加適量石英砂研磨，加無菌水混勻，100 y L涂布于LB固體培養基上，30°C，培養 48h ； (2) 挑取單菌落在LB固體培養基上反復劃線純化，直到得到純系菌株為止； (3) 將純系菌株接種于LB液體培養基中，30°C培養18h，取菌液700 y L加入質量濃度 為50%的甘油300 y L，混合后置于-70°C冰柜中冷凍保存； (4) 將所得的純系菌株，通過侵染雜交狼尾草苗驗證其促生長活性后，鑒定，并保存菌 種，其中一株分離純化所得的內生細菌命名為PP〇 1。
[0008] 本發明的象草內生菌鞘氨醇單胞菌ppOl，具有如下生物學特征： 1. 菌落形態特征：在LB固體培養基上生長良好，菌落呈圓形，黃色，全緣，光滑，菌落中 心突起脊狀； 2. 菌體形態特征：桿狀，直徑0. 6~1. 6 ym，革蘭氏陰性； 3. 部分生理生化特征：可在LB培養基上良好生長，最適生長溫度30°C，最適生長pH 6. 0 ； 4. 遺傳學特征：根據《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠，蔡妙英，科學出版社，2001)， 本發明的鞘氨醇單胞菌CGMCC 9414形態特征與鞘氨醇屬最接近，該鞘氨醇單胞菌經16S rDNA通用引物27F和534R進行PCR擴增部分基因序列（442bp)已向美國國家生物技術 信息中心（NCBI)的Genbank基因序列數據庫提交，登錄號為KM220524。該鞘氨醇單胞 菌CGMCC 9414 16S rDNA序列分析表明，與Genbank國際數據庫中記錄的最相似的菌株 SphingomonaspaucimobilisDSM 30198 (NR 104893. 1) 98%〇 氨醇單胞菌CGMCC 9414應屬于鞘氨醇單胞菌屬sp.)。
[0009] 本發明的另一目的是提供該鞘氨醇單胞菌的用途。
[0010] 所述的內生菌用于促進植物的生長，具體操作是：將雜交狼尾草種子消毒，置于 1/2 MS培養基，25°C，暗培養48小時催芽，將催芽后的種子播種于裝滿蛭石的盆缽中，苗長 至10天左右，用PP〇l發酵原液灌根，侵染3天后，開始并每隔四天澆6 mg /mL鹽水，20天后 測量苗高并稱鮮重。
[0011] 所述的內生菌能在植物體內定殖，是按如下方法進行驗證：取上述灌根侵染鞘氨 醇單胞菌ppoi 3天的雜交狼尾草苗的根，經表面消毒，石英砂研磨，加無菌水混勻，100 y L 涂布于LB固體培養基上，30°C，培養48h，觀察菌落生長情況，并隨機挑取3個單克隆，搖 菌，經16SrDNA測序對菌株進行分子鑒定，以未侵染的雜交狼尾草苗根作為對照。 本發明對所述鞘氨醇單胞菌CGMCC 9414經分泌植物生長素性能及固氮酶活性、產鐵 載體等促生性能測定及盆栽實驗發現，鞘氨醇單胞