戊唑醇與萘啶酮酸混合進行萊茵衣藻培養過程中除菌方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種萊茵衣藻除細菌與真菌的方法，特別是一種戊唑醇與萘啶酮酸混合進行萊茵衣藻培養過程中除菌方法。
【背景技術】
[0002]萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是一種真核單細胞微藻，具有生長周期短，易于培養，基因組已被注釋，相關遺傳生化技術與分子生物學技術成熟，具備重金屬吸附能力，油脂生產量高等特點，而被作為生命科學研宄與應用的模式生物，目前已經開展了纖毛類疾病模型衣藻的研宄，以及生物柴油與生物去污的研宄。然而在科學研宄與應用過程中不可避免的在接種的時候造成衣藻藻種的污染問題，而這些雜菌污染會危及到衣藻藻種的保存，特別是稀有藻種，以及影響研宄結果的準確性。
[0003]目前的除菌方法包括有物理方法與化學方法。
[0004]在物理方法中，常用單克隆劃線或鋪板法與離心沉淀洗脫法。單克隆劃線法要求將雜菌污染的衣藻藻種挑取少許進行培養基平板劃線，單克隆鋪板法要求將雜菌污染的衣藻藻種使用少許液體培養基重懸后再鋪平板，培養數日，二者都將使得衣藻細胞與污染雜菌分離，將未污染衣藻單克隆細胞挑出至新的平板，保種。離心沉淀洗脫法要求將雜菌污染的衣藻藻種使用液體培養基重懸后進行低速離心^OOg)，使得衣藻細胞體沉淀至底部，去除上清污染液，可多次洗滌沉淀，最后鋪板，培養數日，將未污染衣藻單克隆細胞挑出至新的平板，保種。但是上訴常用的物理方法對于污染嚴重的衣藻藻種的成功率很低，并且離心沉淀洗脫法對于具有高粘附性細菌也是不起作用的。
[0005]在化學方法中，Mahan等研宄者發現使用20?40ug/mL的多菌靈、甲基托布津、苯菌靈三種苯并咪唑類除真菌劑均可有效去除衣藻的真菌污染(Mahan, 2005, B1Techniques) ;Kan等研宄者進一步研宄發現組合使用多菌靈(40ug/mL)、氨芐青霉素(500ug/mL)、頭孢噻肟(100Ug/mL)可以有效去除混合細菌和真菌的污染(Kan, 2009, Journal of Phycology)。然而，現有化學去除雜菌的方法并不是持續有效的，特別是研宄環境中持續使用一種混合抗菌劑，會使細菌真菌產生抗性從而引起失效。
[0006]萊茵衣藻為Chlamydomonasreinhardtii，在實驗室的條件下，易受到操作不當等因素導致細菌與真菌的污染，并且造成衣藻污染的情況復雜多變，污染的細菌真菌的種類不定。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是要提供一種戊唑醇與萘啶酮酸混合進行萊茵衣藻培養過程中除菌方法，解決目前在防治衣藻實驗與應用過程中出現的雜菌污染的問題。
[0008]本發明的目的是這樣實現的:該除菌方法如下:雜菌污染的衣藻轉接劃線至含有混合抗菌劑的TAP固體培養基平板上，在23±0.5°C, 14/10小時明暗光周期，8000Lx光強下進行培養5-8天，實現衣藻的除菌；所述的混合抗菌劑包括10ug/ml抗真菌劑和15ug/ml抗細菌劑；所述的抗真菌劑為戊唑醇；抗細菌劑為萘啶酮酸。
[0009]所述實驗藻種為:萊茵衣藻，即Chlamydomonasreinhardtii。
[0010]所述的TAP固體培養基平板為:TAP鹽溶液25ml/L，磷酸鹽溶液0.375ml/L，Hutner微量元素lml/L，乙酸lml/L，Tris 2.42g/L，瓊脂粉15g/L，121 °C高壓蒸汽滅菌20min，倒平板備用；所述的 TAP 鹽溶液為:NH4Cl 15g/L, MgSO4.7Η20 4g/L, CaCl2.2Η20 2g/L ;所述的磷酸鹽溶液為！K2HPO4 288g/L, KH2PO4 144g/L ;所述的Hutner微量元素為:EDTA二鈉鹽 50g/L, ZnSO4.7H20 22g/L, H3BO3 11.4g/L, MnCl2.4H20 5.06g/L, CoCl.6H201.61g/L, CuSO4.5H20 1.57g/L, (NH4)6Mo7O24.4H20 1.lg/L, FeSO4.7H20 4.99g/L，用 KOH 或者 HCl調節pH至7.0。
[0011]所述含有混合抗菌劑的類型、濃度與使用方法為:抗真菌劑戊唑醇使用終濃度10ug/ml，在上述TAP固體培養基配制時添加，抗細菌劑萘啶酮酸使用終濃度15ug/ml，在上述TAP固體培養基配制滅菌以后，冷卻至約55°C后添加。
[0012]有益效果，由于采用了上述方案，利用抗真菌劑戊唑醇與抗細菌劑萘啶酮酸混合進行衣藻雜菌去除。抗真菌劑戊唑醇屬于三唑類殺菌劑，能夠抑制真菌麥角留醇的合成從而抑制真菌細胞膜功能，具有廣譜殺菌性。抗細菌劑萘啶酮酸能夠抑制細菌DNA的合成，具有寬廣的抗菌譜。目前未報道使用戊唑醇與萘啶酮酸混合抗菌劑進行衣藻污染的去除，該方法具有廣譜殺菌特性，適用于各個研宄環境下細菌真菌污染的去除，特別是對于多菌靈、氨芐青霉素、頭孢噻肟混合除菌方法無效的衣藻污染藻種的除菌。本方法比多菌靈等混合除菌法的成本低，效果好，配制方便，應用價值高。該方法具有不抑制衣藻本身生長，并且除混合菌能力強，操作方法簡便，易于推廣應用，能夠有效防治衣藻實驗與應用過程中出現的雜菌污染問題，達到了本發明的目的。
[0013]優點:利用戊唑醇與萘啶酮酸混合抗菌劑有效的進行衣藻細菌與真菌污染的處理，能有效解決利用衣藻進行科學實驗與應用過程中產生的雜菌污染問題，利于珍貴萊茵衣藻藻種的保存以及科學實驗的準確性，具有很好的推廣應用價值。
[0014]a、本發明所采用的除菌劑戊唑醇與萘啶酮酸未曾報道用于萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的除菌。該藻株種質資源豐富，基因組小，功能保守，遺傳分析與生化分析簡單，是進行生命科學研宄的常用模式生物，本方案應用范圍廣。
[0015]b、本發明所采用的除菌劑戊唑醇與萘啶酮酸混合除菌效果較之前所報道的多菌靈與氨芐抗生素、頭孢抗生素混合除菌效果要好，可以在使用后者混合除菌劑不能得到較好除菌效果時采用本方案。
[0016]C、本發明提供了混合除菌劑的另一方案，為防止雜菌抗性產生，可以將本方案與多菌靈、氨芐抗生素、頭孢抗生素混合除菌方案交替使用，已達到最優效果。
[0017]d、本發明能有效解決利用衣藻進行科學實驗與應用過程中產生的雜菌污染問題，利于珍貴萊茵衣藻藻種的保存以及科學實驗的準確性，具有很好的推廣應用價值。
【附圖說明】
:
[0018]圖1是污染萊茵衣藻在普通TAP固體培養基平板上生長狀況圖。
[0019]圖2是污染萊茵衣藻在多菌靈、氨芐抗生素、頭孢抗生素混合除菌方案的平板上生長狀況圖。
[0020]圖3是污染萊茵衣藻在本發明的戊唑醇、萘啶酮酸混合除菌方案的平板上生長狀況圖。
【具體實施方式】
[0021]該除菌方法如下:雜菌污染的衣藻轉接劃線至含有混合抗菌劑的TAP固體培養基平板上，在23±0.5°C, 14/10小時明暗光周期，8000Lx光強下進行培養5_8天，實現衣藻的除菌；所述的混合抗菌劑包括10ug/ml抗真菌劑即戊挫醇和15ug/ml抗細菌劑即萘啶酮酸。
[0022]所述實驗藻種為:萊茵衣藻，即Chlamydomonasreinhardtii。
[0023]所述的TAP固體培養基平板為:TAP鹽溶液25ml/L，磷酸鹽溶液0.375ml/L，Hutner微量元素lml/L，乙酸lml/L，Tris 2.4