腦膜炎球菌莢膜多糖單克隆抗體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及雜交瘤細胞系及其產生的單克隆抗體與應用，特別是設及針對腦膜炎 雙球菌A、C、化35、Y血清型的四種英膜多糖的單克隆抗體和分泌該抗體的雜交瘤細胞系W 及含有該抗體的試劑盒的應用。
【背景技術】
[0002] 流行性腦脊髓膜炎（流腦）已發現100余年，至今仍在不少國家流行，也是 我國冬、春季比較常見的急性呼吸道傳染病。該病是由腦膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitides)引起的腦膜炎。據統計，每年的2~4月，"流腦"的發病率占全年的60% 左右。病人主要是15歲W下的少年兒童，特別是6個月至2歲的嬰幼兒容易感染。其特點 是起病急、病情重、變化多、傳播快、流行廣、來勢兇猛、病死率高、危害性大，所W必須切實 做好預防工作。
[0003] 腦膜炎雙球菌屬奈瑟氏菌屬，革蘭氏染色陰性，腎形，多成對排列，或四個相聯。根 據本菌的夾膜多糖抗原的不同，通過血凝試驗將本菌分為A、B、C、D、X(1916)、Y(1889)、Z、 ￥135(319)、2犯（1892)、山1、1(和113個血清群。^4、8、(：群為多見。腦膜炎雙球菌細菌 素（meningocin)又可將A群分為4型，C群分為6型；B群分為11型，其中B群2型致病力 最強。根據其脂多糖（CP巧將腦膜雙球菌分為8個LPS免疫型，與致病關系尚不清楚。
[0004] 近20年來歐美一些國家的流行菌群已由A群轉變為B群和C群；我國的流行菌群 主要是A群，B群僅占少數。但帶菌者WB、C群為主，今后是否會成為主要流行菌群，有待 于密切觀察。
[0005] 腦膜炎雙球菌是不斷變遷的，在腦膜炎球菌的13個血清群中，A群B群C群Y群 和化35群引起的病例可達95%，無論是成人或兒童，對化35群流腦普遍易感。四價多糖疫 苗針對的是包括奈瑟腦膜炎球菌A、C、化35、Y的4個血清群，具有保護率高（85% -95% )、 反應率低（無全身反應和發熱反應）及免疫有效期長（約2~3年）的=大優點。
[0006] 目前在國內外尚未見到快速有效特異檢測腦膜炎球菌英膜多糖的化ISA試劑盒 的報道。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供腦膜炎球菌A、C、Y、化35群英膜多糖（血清型）的單克隆抗 體、產生該抗體的雜交瘤細胞系W及單克隆抗體的應用。
[000引本發明提供一種單克隆抗體，分別W4種腦膜炎球菌英膜多糖為免疫原，免疫動 物制備獲得；
[0009] 其中，4種腦膜炎球菌英膜多糖的血清型分別為A、C、Y和W135 ;所述單克隆抗體 特異性地識別A、C、Y和化35腦膜炎球菌病原體。
[0010] 所述載體蛋白為白喉毒素CRM197蛋白或破傷風類毒素TT蛋白。
[0011] 本發明制備單克隆抗體過程中，免疫使用的動物為小鼠。
[0012] 本發明提供了 8種單克隆抗體，分別是腦膜炎球菌A、C、Y、化35群多糖的單克隆 抗體。
[0013] 具體地說是分別W腦膜炎球菌結合疫苗中的A、C、Y、化35英膜多糖為免疫原免疫 小鼠，采用雜交瘤技術經過細胞融合并篩選得到能持續、穩定分泌A、C、Y或化35群腦膜炎 球菌多糖的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，由各細胞株分泌得到8種單克隆抗體。
[0014] 本發明提供的單克隆抗體能特異識別腦膜炎球菌A血清型多糖的單克隆抗體為 Clone6B7和Clone6B12;特異識別腦膜炎球菌C血清型多糖的單克隆抗體為Clone2H4和 Clone5B3;特異識別腦膜炎球菌化35血清型多糖單克隆抗體為CloneSFl和Clone4服；特 異識別腦膜炎球菌Y血清型多糖的單克隆抗體為Clone7C6和Clone3A2;
[0015] 所述單克隆抗體Clone6B7的輕鏈可變區和重鏈可變區的氨基酸序列分別如SEQ IDNo. 1和2所示；
[0016] 所述單克隆抗體Clone6B12的輕鏈可變區和重鏈可變區的氨基酸序列分別如SEQ IDNo. 3和4所示；
[0017] 所述單克隆抗體Clone2H4的輕鏈可變區和重鏈可變區的氨基酸序列分別如SEQ IDNo. 5和6所示；
[0018] 所述單克隆抗體Clone5B3的輕鏈可變區和重鏈可變區的氨基酸序列分別如SEQ IDNo.7和8所示；
[0019] 所述單克隆抗體CloneSFl的輕鏈可變區和重鏈可變區的氨基酸序列分別如SEQ IDNo.9和10所示；
[0020] 所述單克隆抗體Clone4服的輕鏈可變區和重鏈可變區的氨基酸序列分別如SEQ IDNo.11 和 12 所示；
[0021] 所述單克隆抗體Clone7C6的輕鏈可變區和重鏈可變區的氨基酸序列分別如SEQ IDNo. 13和14所示；
[0022] 所述單克隆抗體Clone3A2的輕鏈可變區和重鏈可變區的氨基酸序列分別如SEQ IDNo.15 和 16 所示。
[0023] 本發明提供了能穩定分泌上述單克隆抗體的雜交瘤細胞。
[0024]本發明針對每種血清型各自獲得的單克隆抗體具有良好的特異性，實驗表明，每 種血清型的單克隆抗體與其它3種血清型的腦膜炎球菌英膜多糖抗原沒有顯著的交叉反 應，間接化ISA表明該些抗體具有較高的效價，因此可用于A、C、Y、化35群腦膜炎球菌英膜 多糖的檢測。可W采用雙抗夾屯、法，分別利用兩個單克隆抗體對各型英膜多糖進行檢測。
[0025] 本發明提供了上述8種單克隆抗體中任一種單克隆抗體在制備腦膜炎球菌檢測 試劑盒中的應用。
[0026] 本發明提供了上述8種單克隆抗體中任一種單克隆抗體在制備腦膜炎球菌英膜 多糖A、C、Y或化35抗體檢測試劑盒中的應用。
[0027] 含有上述任一種或多種單克隆抗體的藥物屬于本發明的保護范圍。
[002引本發明提供了上述8種單克隆抗體任一種或多種單克隆抗體在制備腦膜炎球菌 預防性藥物中的應用。
[0029] 本發明提供了含有上述任一種或多種單克隆抗體的檢測試劑盒。
[0030] 本發明提供一種用于腦膜炎英膜多糖檢測的試劑盒。
[0031] 本發明提供的檢測試劑盒，其為化ISA檢測試劑盒，其w特異性地識別腦膜炎球 菌A血清型多糖的一種單克隆抗體為包被抗體，W酶標記的異性地識別腦膜炎球菌A血清 型多糖的另一種單克隆抗體作為檢測抗體，所述單克隆抗體為Clone6B7或Clone6B12。
[0032] 本發明提供的檢測試劑盒，其為化ISA檢測試劑盒，其W特異性地識別腦膜炎球 菌C血清型多糖的一種單克隆抗體為包被抗體，W酶標記的異性地識別腦膜炎球菌C血清 型多糖的另一種單克隆抗體作為檢測抗體，所述單克隆抗體為Clone2H4和Clone5B3。
[0033] 本發明提供的檢測試劑盒，其為化ISA檢測試劑盒，其W特異性地識別腦膜炎 球菌化35血清型多糖的一種單克隆抗體為包被抗體，W酶標記的異性地識別腦膜炎球 菌化35血清型多糖的另一種單克隆抗體作為檢測抗體，所述單克隆抗體為CloneSFl和 Clone4 服。
[0034] 本發明提供的檢測試劑盒，其為化ISA檢測試劑盒，其W特異性地識別腦膜炎球 菌Y血清型多糖的一種單克隆抗體為包被抗體，W酶標記的異性地識別腦膜炎球菌Y血清 型多糖的另一種單克隆抗體作為檢測抗體，所述單克隆抗體為Clone7C6和Clone3A2。
[0035] 本發明提供了上述單克隆抗體在制備檢測4種腦膜炎球菌英膜多糖試劑盒中的 應用，所述4種腦膜炎球菌英膜多糖的血清型分別為A、C、Y和化35。
[0036] 本發明提供的各型英膜多糖特異的單克隆抗體分別與其它ACYW135群腦膜炎球 菌型英膜多糖無明顯交叉反應，用于檢測A、C、Y、化35群腦膜炎球菌英膜多糖具有高特異 性、高敏感性的優點，可W準確檢測樣品中各型多糖組分的水平，廣泛應用于臨床檢測和疫 苗廠家生產疫苗過程中的質檢。
【附圖說明】
[0037] 圖1是抗體的SDS-PA(iE電泳圖，其中M是蛋白分子量標準（kDa)，本發明獲得的8 種單克隆抗體，泳道1-9分別為BSA她7、她12、2擬、583、5。1、4服、7〔6、342單抗。
[003引圖2所示的是腦膜炎球菌A多糖化ISA法靈敏度實驗的擬合曲線。
[0039] 圖3所示的是腦膜炎球菌C多糖化ISA法靈敏度實驗的擬合曲線。
[0040] 圖4所示的是腦膜炎球菌化35多糖化ISA法靈敏度實驗的擬合曲線。
[0041] 圖5所示的是腦膜炎球菌Y多糖ELISA法靈敏度實驗的擬合曲線。
[0042] 具體實施方法
[0043] W下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離 本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明 的范圍。
[0044] 若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的