用于控制植物病毒感染的方法和組合物的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的奪叉引用
[0002] 本申請要求2012年10月16日提交的美國臨時專利申請號61/714, 733和2013 年3月14日提交的美國臨時專利申請號61/786, 032的權益，這些專利以引用的方式整體 并入本文。
[0003] 序列表的合并
[0004] 包含在名稱為"M0NS317W0sequencelisting. txt"的文件中的序列表如在 Microsoft Windows操作系統中所測量是251千字節且在2013年10月11日生成，所述序 列表與此一起以電子方式提交并且以引用的方式并入本文。
技術領域
[0005] 所述方法和組合物大體上涉及植物疾病控制領域。更具體地說，本發明涉及用于 治療或預防與植物番茄斑萎病毒屬或雙生病毒組感染有關的癥狀的方法和組合物。
【背景技術】
[0006] 番茄斑萎病毒屬和雙生病毒組的植物病毒在經濟學上是重要的，它們導致減少的 植物產量和感染植物的死亡。設法保護其作物不受番茄斑萎病毒屬侵害的種植者在傳統上 試圖以殺蟲劑施用或用反光膜或塑料蓋防護其作物不受昆蟲媒介的危害。因為這些策略取 得了有限的成功，并且是昂貴和勞動密集型的，所以需要用于控制番茄斑萎病毒屬和雙生 病毒組感染的替代性策略。
【發明內容】
[0007] 本文所述的實施方案涉及用于預防或治療植物中的病毒感染的方法和組合物，其 包括向植物局部施用包含至少18個與病毒基因基本上相同或基本上互補的連續核苷酸的 多核苷酸。多核苷酸可以是單鏈DNA(ssDNA)、雙鏈DNA(dsDNA)、單鏈RNA(ssRNA)或雙鏈 RNA (dsRNA) 〇
[0008] -方面，本發明提供一種治療或預防植物中的番茄斑萎病毒屬感染的方法，其包 括：向所述植物局部地施用包含反義單鏈DNA多核苷酸和轉移劑的組合物，其中所述反義 單鏈DNA多核苷酸與必需的番茄斑萎病毒屬基因序列或其RNA轉錄物的全部或一部分互 補，其中病毒感染的癥狀或癥狀的發展在所述植物中相對于當在相同條件下生長時不用所 述組合物治療的植物是減少或排除的。在一些實施方案中，反義單鏈DNA多核苷酸包含至 少18個與選自由SEQ ID NO: 13-46組成的組的序列基本上互補的連續核苷酸。在一個實 施方案中，轉移劑是有機硅表面活性劑組合物或包含在其中的化合物。在另一實施方案中， 所述組合物包含超過一種反義單鏈DNA多核苷酸，所述反義單鏈DNA多核苷酸與必需的番 茄斑萎病毒屬基因序列、所述必需的番茄斑萎病毒屬基因序列的RNA轉錄物、或其片段的 全部或一部分互補。在另一實施方案中，反義單鏈DNA多核苷酸選自由SEQ NO: 1-12或其 片段組成的組。在另一實施方案中，所述番茄斑萎病毒屬選自由以下組成的組：豆壞死花 葉病毒、辣椒萎黃病病毒、落花生芽壞死病毒、落花生環斑病毒、落花生黃斑病毒、風仙花壞 死斑病毒、鳶尾黃斑病毒、甜瓜黃斑病毒、花生芽壞死病毒、花生黃斑病毒、大豆葉脈壞死相 關病毒、番茄褪綠斑病毒、番茄壞死環斑病毒、番茄斑萎病毒、番茄帶斑病毒、西瓜芽壞死病 毒、西瓜銀色斑駁病毒以及綠皮密生西萌蘆致命萎黃病病毒。在另一實施方案中，必需的 番茄斑萎病毒屬基因選自由以下組成的組：核衣殼基因（N)、外殼蛋白基因（CP)、毒力因子 NSm和NSs、以及RNA依賴性RNA聚合酶L節段（RdRp/L節段）。在另一實施方案中，必需的 基因序列選自由SEQ ID NO: 13-46組成的組。在另一實施方案中，組合物通過噴霧、撒粉來 局部施用，或作為基質包裹的DNA施用于植物表面。
[0009] 另一方面，本發明提供一種包含反義單鏈DNA多核苷酸和轉移劑的組合物，其中 所述反義單鏈DNA多核苷酸與必需的番前斑萎病毒屬基因序列或其RNA轉錄物的全部或一 部分互補，其中所述組合物局部地施用于植物并且其中番茄斑萎病毒屬感染的癥狀或癥狀 的發展在所述植物中相對于當在相同條件下生長時不用所述組合物治療的植物是減少或 排除的。在一些實施方案中，必需的基因序列選自由SEQ ID NO: 13-46組成的組，或轉移劑 是有機硅組合物，或反義單鏈DNA多核苷酸選自由SEQ ID NO: 1-12組成的組。
[0010] 另一方面，本發明提供一種減少必需的番茄斑萎病毒屬基因表達的方法，其包括 將番茄斑萎病毒屬顆粒與包含反義單鏈DNA多核苷酸和轉移劑的組合物接觸，其中所述反 義單鏈DNA多核苷酸與所述番茄斑萎病毒屬中必需的基因序列或其RNA轉錄物的全部或一 部分互補，其中番茄斑萎病毒屬感染的癥狀或癥狀的發展在所述植物中相對于當在相同條 件下生長時不用所述組合物治療的植物是減少或排除的。在一個實施方案中，必需的基因 序列選自由SEQ ID NO: 13-46組成的組。在另一實施方案中，轉移劑是有機硅化合物。在 另一實施方案中，反義單鏈DNA多核苷酸選自由SEQ ID NO: 1-12或其片段組成的組。
[0011] 另一方面，本發明提供一種鑒定當局部地治療植物時適用于調節番茄斑萎病毒屬 基因表達的反義單鏈DNA多核苷酸的方法，其包括：a)提供包含與必需的番茄斑萎病毒屬 基因或其RNA轉錄物的全部或一部分互補的區域的多個反義單鏈DNA多核苷酸；b)用所述 反義單鏈DNA多核苷酸中的一個或多個和轉移劑局部地治療所述植物；c)分析所述植物或 提取物用于調節番茄斑萎病毒屬感染的癥狀；以及d)選擇能調節番茄斑萎病毒屬感染的 癥狀或發生的反義單鏈DNA多核苷酸。在一個實施方案中，轉移劑是有機硅化合物。
[0012] 另一方面，本發明提供一種包含反義單鏈DNA多核苷酸和農藥的混合物的農業化 學組合物，其中所述反義單鏈DNA多核苷酸與必需的番茄斑萎病毒屬基因序列或其RNA轉 錄物的全部或一部分互補，其中所述組合物局部地施用于植物并且其中番茄斑萎病毒屬感 染的癥狀或癥狀的發展在所述植物中相對于當在相同條件下生長時不用所述組合物治療 的植物是減少或排除的。在一個實施方案中，農藥選自由以下組成的組：抗病毒化合物、殺 蟲劑、殺真菌劑、殺線蟲劑、殺菌劑、殺螨劑、生長調節劑、化學絕育劑、化學信息素、驅避劑、 弓丨誘劑、信息素、取食刺激劑以及生物殺蟲劑。
[0013] 另一方面，本發明提供一種治療或預防植物中的番茄斑萎病毒屬感染的方法，其 包括：向所述植物局部地施用包含雙鏈RNA多核苷酸和轉移劑的組合物，其中所述雙鏈RNA 包含與必需的番茄斑萎病毒屬基因序列或其RNA轉錄物的全部或一部分基本上互補的多 核苷酸，其中病毒感染的癥狀或癥狀的發展在所述植物中相對于當在相同條件下生長時不 用所述組合物治療的植物是減少或排除的。在一些實施方案中，雙鏈RNA包含與選自由SEQ ID NO: 13-46組成的組的序列的至少18個連續核苷酸基本上相同或基本上互補的多核苷 酸。在一個實施方案中，轉移劑是有機硅表面活性劑組合物或包含在其中的化合物。在另 一實施方案中，所述組合物包含超過一種雙鏈RNA，所述雙鏈RNA包含與必需的番茄斑萎病 毒屬基因序列、所述必需的番茄斑萎病毒屬基因序列的RNA轉錄物、或其片段的全部或一 部分互補的多核苷酸。在另一實施方案中，雙鏈RNA多核苷酸包含與如SEQ N0:47-103、 448-483中所列舉的核苷酸序列或其片段基本上相同或基本上互補的多核苷酸。在一些實 施方案中，dsRNA的反義多核苷酸包含懸突在3'端上的與靶基因互補的二（2)核苷酸。在 另一實施方案中，所述番茄斑萎病毒屬選自由以下組成的組：豆壞死花葉病毒、辣椒萎黃病 病毒、落花生芽壞死病毒、落花生環斑病毒、落花生黃斑病毒、風仙花壞死斑病毒、鳶尾黃斑 病毒、甜瓜黃斑病毒、花生芽壞死病毒、花生黃斑病毒、大豆葉脈壞死相關病毒、番茄褪綠斑 病毒、番茄壞死環斑病毒、番茄斑萎病毒、番茄帶斑病毒、西瓜芽壞死病毒、西瓜銀色斑駁病 毒以及綠皮密生西萌蘆致命萎黃病病毒。在另一實施方案中，必需的番茄斑萎病毒屬基因 選自由以下組成的組：核衣殼基因（N)、外殼蛋白基因（CP)、毒力因子NSm和NSs、以及RNA 依賴性RNA聚合酶L節段（RdRp/L節段）。在另一實施方案中，必需的番茄斑萎病毒屬基 因選自由SEQ ID NO: 13-46組成的組。在另一實施方案中，組合物通過噴霧、撒粉來局部施 用，或作為基質包裹的RNA施用于植物表面。
[0014] 另一方面，本發明提供一種包含雙鏈RNA多核苷酸和轉移劑的組合物，其中所述 雙鏈RNA多核苷酸與必需的番茄斑萎病毒屬基因序列或其RNA轉錄物的全部或一部分互 補，其中所述組合物局部地施用于植物并且其中番茄斑萎病毒屬感染的癥狀或癥狀的發展 在所述植物中相對于當在相同條件下生長時不用所述組合物治療的植物是減少或排除的。 在一個實施方案中，必需的基因序列選自由SEQ ID NO: 13-46組成的組。在另一實施方案 中，轉移劑是有機硅組合物。在另一實施方案中，雙鏈RNA包含與選自由SEQ NO: 47-103和 448-483組成的組的核苷酸序列基本上相同或基本上互補的多核苷酸。在一些實施方案中， dsRNA的反義多核苷酸包含懸突在3'端上的與靶基因互補的二（2)核苷酸。
[0015] 另一方面，本發明提供一種減少必需的番茄斑萎病毒屬基因表達的方法，其包括： 將番茄斑萎病毒屬顆粒與包含雙鏈RNA多核苷酸和轉移劑的組合物接觸，其中所述雙鏈 RNA包含與所述番茄斑萎病毒屬中必需的基因序列或其RNA轉錄物的全部或一部分互補的 多核苷酸，其中番茄斑萎病毒屬感染的癥狀或癥狀的發展在所述植物中相對于當在相同條 件下生長時不用所述組合物治療的植物簡而言之減少或排除的。在一個實施方案中，必需 的基因序列選自由SEQ ID NO: 13-46組成的組。在另一實施方案中，轉移劑是有機硅化合 物。在另一實施方案中，雙鏈RNA包含與選自由SEQ ID N0:47-103、448-483或其片段組成 的組的核苷酸序列基本上相同或基本上互補的多核苷酸。在一些實施方案中，dsRNA的反 義多核苷酸包含懸突在3'端上的與靶基因互補的二（2)核苷酸。
[0016] 另一方面，本發明提供一種鑒定當局部地治療植物時適用于調節番茄斑萎病毒屬 基因表達的雙鏈RNA多核苷酸的方法，其包括：a)提供包含與必需的番茄斑萎病毒屬基因 或其RNA轉錄物的全部或一部分互補的區域的多個雙鏈RNA多核苷酸；b)用所述雙鏈RNA 多核苷酸中的一個或多個和轉移劑局部地治療所述植物；c)分析所述植物或提取物用于 調節番茄斑萎病毒屬感染的癥狀；以及d)選擇能調節番茄斑萎病毒屬感染的癥狀或發生 的雙鏈RNA多核苷酸。在一個實施方案中，轉移劑是有機硅化合物。在一些實施方案中，雙 鏈RNA包含與選自由SEQ ID NO: 13-46組成的組的序列的至少18個連續核苷酸基本上相 同或基本上互補的多核苷酸。
[0017] 另一方面，本發明提供一種包含雙鏈RNA多核苷酸和農藥的混合物的農業化學組 合物，其中所述雙鏈RNA包含與必需的番茄斑萎病毒屬基因序列或其RNA轉錄物的全部或 一部分基本上互補的多核苷酸，其中所述組合物局部地施用于植物并且其中番茄斑萎病毒 屬感染的癥狀或癥狀的發展在所述植物中相對于當在相同條件下生長時不用所述組合物 治療的植物是減少或排除的。在一個實施方案中，農藥選自由以下組成的組：抗病毒化合 物、殺蟲劑、殺真菌劑、殺線蟲劑、殺菌劑、殺蝴劑、生長調節劑、化學絕育劑、化學?目息素、驅 避劑、引誘劑、信息素、取食刺激劑以及生物殺蟲劑。
[0018] 又一方面，本發明提供一種治療或預防植物中的雙生病毒組感染的方法，其包括： 向所述植物局部地施用包含雙鏈RNA多核苷酸和轉移劑的組合物，其中所述雙鏈RNA包含 與必需的雙生病毒組基因序列或其RNA轉錄物的全部或一部分互補的多核苷酸，其中病毒 感染的癥狀或癥狀的發展在所述植物中相對于當在相同條件下生長時不用所述組合物治 療的植物是減少或排除的。在一個實施方案中，轉移劑是有機硅表面活性劑組合物或包含 在其中的化合物。在另一實施方案中，組合物包含超過一種雙鏈RNA，所述雙鏈RNA包含 與必需的雙生病毒組基因序列、所述必需的雙生病毒組基因序列的RNA轉錄物、或其片段 的全部或一部分基本上互補的多核苷酸。在另一實施方案中，雙鏈RNA包含與選自由SEQ NO: 104-268或其片段組成的組的序列的至少18個核苷酸基本上相同或基本上互補的多 核苷酸。在另一實施方案中，雙生病毒組選自由以下組成的組：大麥黃矮病病毒、黃瓜花葉 病毒、茄瓜花葉病毒、棉花縮葉病毒、番茄黃色縮葉病毒、番茄金色花葉病毒、馬鈴薯黃化葉 病毒、胡椒縮葉病毒、S金色花葉病毒、S金色花葉病毒、番前斑駁病毒。又一方面，必需的 雙生病毒組基因選自由以下組成的組：核衣殼基因（N)、外殼蛋白基因（CP)、毒力因子NSm 和NSs、以及RNA依賴性RNA聚合酶L節段（RdRp/L節段）、沉默抑制基因、移動蛋白（MP)、 附&、0?-隊三基因塊、0?-?3、1^-?4、02以及八02。在另一實施方案中，必需的基因序列選自 由SEQ ID N0:269-447組成的組。在另一實施方案中，組合物通過噴霧、撒粉來局部施用， 或作為基質包裹的RNA施用于植物表面。
[0019] 另一方面，本發明提供一種包含雙鏈RNA多核苷酸和轉移劑的組合物，其中所述 雙鏈RNA包含與必需的雙生病毒組基因序列如由SEQ ID N0:104-268、269-447所列舉的一 個或其RNA轉錄物的全部或一部分基本上互補的多核苷酸，其中所述組合物局部地施用于 植物并且其中雙生病毒組感染的癥狀或癥狀的發展在所述植物中相對于當在相同條件下 生長時不用所述組合物治療的植物是減少或排除的。在一個實施方案中，必需的基因序列 選自由SEQ ID N0:269-447組成的組。在另一實施方案中，轉移劑是有機硅組合物。在另 一實施方案中，雙鏈RNA多核苷酸選自由SEQ NO: 104-268組成的組。
[0020] 另一方面，本發明提供一種減少必需的雙生病毒組基因表達的方法，其包括：將雙 生病毒組顆粒與包含雙鏈RNA多核苷酸和轉移劑的組合物接觸，其中所述雙鏈RNA包含與 所述雙生病毒組中必需的基因序列或其RNA轉錄物的全部或一部分基本上互補的多核苷 酸，其中雙生病毒組感染的癥狀或癥狀的發展在所述植物中相對于當在相同條件下生長時 不用所述組合物治療的植物是減少或排除的。在一個實施方案中，必需的基因序列選自由 SEQ ID N0:269-447組成的組。在另一實施方案中，轉移劑是有機硅化合物。在另一實施方 案中，雙鏈RNA包含與選自由SEQ NO: 104-268或其片段組成的組的序列的至少18個核苷 酸基本上相同或基本上互補的多核苷酸。
[0021] 又一方面，本發明提供一種鑒定當局部地治療植物時適用于調節雙生病毒組基因 表達的雙鏈RNA多核苷酸的方法，其包括：a)提供包含與必需的雙生病毒組基因或其RNA 轉錄物的全部或一部分互補的區域的多個雙鏈RNA多核苷酸；b)用所述雙鏈RNA多核苷酸 中的一個或多個和轉移劑局部地治療所述植物；c)分析所述植物或提取物用于調節雙生 病毒組感染的癥狀；以及d)選擇能調節雙生病毒組感染的癥狀或發生的雙鏈RNA多核苷 酸。在一個實施方案中，轉移劑是有機硅化合物。在一些實施方案中，雙鏈RNA包含與選 自由SEQ ID N0:269-447組成的組的序列的至少18個連續核苷酸基本上相同或基本上互 補的多核苷酸。在一些實施方案中，雙生病毒組是黃瓜花葉病毒并且雙鏈RNA包含與選自 由SEQ ID N0:269-316組成的組的序列的至少18個連續核苷酸基本上相同或基本上互補 的多核苷酸。在一些實施方案中，雙生病毒組是茄瓜花葉病毒并且雙鏈RNA包含與選自由 SEQ I