具有產麥芽糖特性的淀粉酶的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關專利申請的交叉引用
[0002] 本專利申請要求于2012年11月20日提交的國際專利申請No. PCT/ CN2012/084883的權益，該專利申請的內容據此全文以引用方式并入。
技術領域
[0003] 本發明的教導內容提供了與新型產麥芽糖淀粉酶相關的組合物和方法。
【背景技術】
[0004] 淀粉是直鏈淀粉（15-30 %重量/重量）和支鏈淀粉（70-85 %重量/重量）的混 合物。直鏈淀粉由分子量（MW)為約60, 000至約800, 000的α -1，4-連接的葡萄糖單元的 直鏈組成。支鏈淀粉是每24-30個葡萄糖單元含有α -1，6分支點的支鏈聚合物；其MW可 高達一億。
[0005] 濃縮右旋糖漿形式的得自淀粉的糖目前通過酶催化法制備，該方法涉及：（1)用 α -淀粉酶將固體淀粉液化（或降低粘度）成平均聚合度為約7-10的糊精，以及（2)用淀 粉葡糖苷酶（也稱為葡糖淀粉酶或GA)將所得的液化淀粉（即淀粉水解物）糖化。所得的 糖漿具有高葡萄糖含量。大部分商業生產的葡萄糖漿隨后通過酶法異構化為稱為異糖漿 (isosyrup)的右旋糖/果糖混合物。所得的糖漿也可用微生物（諸如酵母）發酵以產生商 品，包括例如乙醇、梓檬酸、乳酸、琥珀酸、衣康酸、谷氨酸一鈉、葡糖酸鹽、賴氨酸、其他有機 酸、其他氨基酸和其他生物化學品。可同時進行發酵和糖化（即SSF工藝）來實現更大的 經濟性和效率。
[0006] α-淀粉酶通過隨機裂解內部的α-l，4-糖苷鍵來水解淀粉、糖原和相關多糖。 α_淀粉酶（特別是來自芽孢桿菌屬（Bacilli)的α-淀粉酶）已被用于各種不同的用途， 包括淀粉液化和糖化、紡織物退漿、造紙和紙漿工業中的淀粉改性、釀造、烘焙、用于食品工 業的糖漿的生產、用于發酵工藝的原料的生產，以及在動物飼料中用于提高消化性。這些酶 也可用于在盤碟洗滌和衣物洗滌過程中除去含淀粉污垢和污漬。
[0007] 麥芽糖是由β-1，4'-糖苷鍵連接的兩種D-吡喃葡萄糖構成的二糖，其在食品/ 冷凍食品、烘焙、釀造和飲料工業的應用方面具有高商業價值。麥芽糖也是用于制備無熱量 糖甜味劑麥芽糖醇的底物。高純度麥芽糖或純麥芽糖是用于糖尿病患者的靜脈注射液的活 性組分。用于制備含有不同水平麥芽糖含量（即，〈50%麥芽糖（高轉化糖漿或低麥芽糖糖 漿）、50-55%麥芽糖（高麥芽糖糖漿）、70-75%麥芽糖（非常高麥芽糖）和>80%麥芽糖 (超高麥芽糖））的糖漿的商業過程已根據具體應用進行了建立。這些過程的共同因素在 于，均涉及具有兩個不同步驟（即液化和糖化）的雙酶工藝。
[0008] 以往，淀粉的水解涉及兩個酶步驟，以制備葡萄糖糖漿或麥芽糖糖漿。第一個步驟 是在高溫（>95°C)下的液化步驟，而第二個步驟是糖化步驟。在麥芽糖制備中，第二個步 驟被稱為麥芽糖糖化并且通常在60°C或60°C以下的溫度下發生。在液化步驟中，通常在 存在添加的鈣的情況下，將不溶性淀粉顆粒在水中漿化，經加熱糊化，并由來自芽孢桿菌屬 物種的熱穩定性α -淀粉酶（EC. 3. 2. I. 1，α -1，4' -D-葡聚糖葡聚糖水解酶）水解。來自 地衣芽抱桿菌（Bacillus Iicheniformis)(例如，得自杜邦-杰能科（DuPont-Genencor) 的SPEZYME? frED或得自諾維信公司（Novozymes)的Termamyl?L-l2〇)、嗜熱脂肪 芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus)(例如，得自杜邦-杰能科的SPEZYME& XTRA、得自諾維信公司的Termamyr' SC和TermamylK' SUPRA)或地衣芽孢桿菌和嗜熱 脂肪芽孢桿菌的共混物（例如，得自杜邦-杰能科的ClearfIowtmAA或得自諾維信公司的 Liqu〇zymeK Supra)的細菌衍生的熱穩定性α-淀粉酶首先用于在高溫（>95°C)、pH 5. 2-6. 5下將淀粉液化為低DE(右旋糖當量）的可溶性淀粉水解物。在麥芽糖糖化步驟中， 通常在低得多的溫度下使用產麥芽糖酶，諸如真菌α-淀粉酶（例如，得自杜邦-杰能科的 CLARASE? L或得自諾維信公司的Fungamyl? 800L)、植物β -淀粉酶（例如，得自杜 邦-杰能科的OPTIMALT? BBA或得自Senson公司的BetalaSel500L)，以進一步水解可 溶性淀粉水解物。對于含有多于60%麥芽糖的麥芽糖糖漿，在液化淀粉的麥芽糖糖化過程 中添加諸如支鏈淀粉酶之類的脫支酶（例如，得自杜邦-杰能科的OPTTMAX x L-1000、 得自諾維信公司的Promozyme? D2或得自諾維信公司的Promozyme? D6)。
【發明內容】
[0009] 在一些實施例中，本發明的教導內容提供了一種分離的核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1的簡并變體的核苷酸序列。
[0010] 在一些實施例中，本發明的教導內容提供了一種分離的核酸，該核酸包含編碼由 SEQ ID N0:3的氨基酸序列組成的多肽的序列。
[0011] 在一些實施例中，本發明的教導內容提供了一種分離的核酸，該核酸包含在嚴格 條件下與雜交探針雜交的序列，該雜交探針的核苷酸序列由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1 的互補序列組成。
[0012] 在一些實施例中，本發明的教導內容提供了一種分離的核酸，該核酸包含與SEQ ID N0:1 至少 66 %、67 %、68 %、69 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、98 %、99 % 或 99. 5%同一的序列。在一些實施例中，本發明的教導內容提供了這樣的分離的核酸，其中該 核酸編碼具有淀粉水解活性的多肽。
[0013] 在一些實施例中，本發明的教導內容提供了一種分離的核酸，該核酸包含編碼與 SEQ ID N0:3 至少 66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或 99. 5%同一的多肽的序列，其中所述多肽具有淀粉水解活性。
[0014] 在一些實施例中，本發明的教導內容提供了一種分離的核酸，該核酸包含編碼包 含以下的序列的多肽的序列：SEQ ID N0:3或者具有最多至50個保守氨基酸置換的SEQ ID NO: 3,其中所述多肽具有淀粉水解活性。
[0015] 在一些實施例中，本發明的教導內容提供了純化的多肽，其氨基酸序列包含與 SEQ ID N0:3 至少 66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或 99. 5%同一的序列。
[0016] 在一些實施例中，本發明的教導內容提供了包含SEQ ID NO: 3但是具有0至20個 保守氨基酸置換的氨基酸序列的純化多肽。
[0017] 在一些實施例中，本發明的教導內容提供了包含有效連接至表達控制序列的權利 要求1-6中任一項所述的核酸序列的表達載體。在一些實施例中，本發明的教導內容提供 了包含這種載體的培養細胞。在一些實施例中，本發明的教導內容提供了包含有效連接至 表達控制序列的本發明教導內容的任何核酸的培養細胞。在一些實施例中，本發明的教導 內容提供了用由本發明教導內容提供的任何載體轉染的培養細胞或所述細胞的子代，其中 所述細胞表達核酸以形成多肽。
[0018] 在一些實施例中，本發明的教導內容提供了制備蛋白質的方法，該方法包括在允 許表達多肽的條件下培養由本發明教導內容提供的細胞。
[0019] 在一些實施例中，本發明的教導內容提供了使用本發明教導內容的多肽的方法， 該方法包括在以下任一項中包括所述多肽：淀粉液化、淀粉糖化、紡織物退漿、造紙和紙漿 工業中的淀粉改性、釀造、烘焙、用于食品工業的糖漿的生產、用于發酵工藝的原料的生產、 動物飼料、以及在盤碟洗滌和/或衣物洗滌過程中除去含淀粉污垢和/或污漬。
[0020] 在一些實施例中，本發明的教導內容提供了包含本發明教導內容的多肽以及至少 一種輔助酶的組合物，所述輔助酶選自植酸酶、蛋白酶、支鏈淀粉酶、β淀粉酶、異淀粉酶、 不同的淀粉酶、α-葡糖苷酶、纖維素酶、木聚糖酶、半纖維素酶、β-葡糖苷酶、轉移酶、果 膠酶、脂肪酶、角質酶、酯酶、膽堿氧化酶、過氧化物酶/氧化酶、果膠酸裂解酶、甘露聚糖 酶、角質酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基轉移酶、過水解酶、芳基酯酶、以及氧化還原酶。
[0021] 通過本發明的描述和附圖，本發明教導內容的組合物和方法的這些方面和其他方 面以及實施例將顯而易見。
【附圖說明】
[0022] 圖1分圖A和分圖B示出了根據本發明教導內容的一些實施例的一些示例性數 據。
[0023] 圖2分圖A和分圖B示出了根據本發明教導內容的一些實施例的一些示例性數 據。
[0024] 圖3示出了根據本發明教導內容的一些實施例的一些示例性數據。
[0025] 圖4示出了根據本發明教導內容的一些實施例的一些示例性數據。
[0026] 圖5示出了根據本發明教導內容的一些實施例的一些示例性數據。
[0027] 圖6示出了根據本發明教導內容的一些實施例的一些示例性數據。
[0028] 圖7示出了根據本發明教導內容的一些實施例的一些示例性數據。
[0029] 圖8示出了根據本發明教導內容的一些實施例的一些示例性數據。
[0030] 圖9示出了根據本發明教導內容的一些實施例的示例性克隆圖譜。
[0031] 序列的簡要說明
[0032] SEQ ID NO: 1示出AmyMG的全長核苷酸序列。
[0033] SEQ ID NO:2示出AmyMG的天然信號序列的核苷酸序列。
[0034] SEQ ID NO:3示出AmyMG的全長氨基酸序列。
[0035]