鼠；
[0124] (C)在所述小鼠的血清中檢測特異性結合性或阻斷性Ab ;
[0125] (d)在來自小鼠的淋巴結細胞與骨髓瘤細胞之間產生雜交瘤，以產生Ab ;和
[0126] (e)用抗原特異性結合試驗篩選雜交瘤。
[0127] 在一些實施方案中，用于產生Ab的抗原是人類的或來自類人靈長類物種。
[0128] 在一些實施方案中，用于產生Ab的抗原是表達內源性或重組的全長抗原或抗原 的抗原性片段的原代細胞或細胞系、或全部或部分抗原和另一蛋白的融合蛋白，或所述抗 原是病毒樣顆粒的部分。
[0129] 在一些實施方案中，用于產生Ab的抗原在與步驟（b)的小鼠同系的細胞系中表 達，或用于產生Ab的抗原與IgG的Fc部分融合。
[0130] 在一些實施方案中，用于產生Ab的抗原是融合于人類IgGl的Fc部分的人類或小 鼠的抗原。
[0131] 在一些實施方案中，用于產生Ab的抗原是在細胞表面上。
[0132] 作為步驟b)、c)和d)的替代，Ab或包括至少V區的其片段可通過對步驟a)的抗 原進行噬菌體展示以選擇Ab序列而獲得。
[0133] 在一些實施方案中，步驟（e)的結合試驗是通過應用可視化的方法來完成的，所 述可視化方法包括：酶聯免疫吸附測定（ELISA)、斑點印跡、免疫印跡、免疫沉淀、流式細胞 術、熒光顯微法、共聚焦顯微法、量熱法、表面等離子體共振、烏赫特朗尼試驗（Ouchterlony test)，補體介導的紅細胞裂解、ADCC等等。優選地mAb的結合試驗是通過直接的或捕獲 ELISA或流式細胞術來完成的。
[0134] 特別地，可通過，例如蛋白A或G或L親和層析、基于抗鼠 IgG Ab的親和層析、離 子交換、乙醇或硫酸銨沉淀等純化Ab。
[0135] 用于制備免疫原和免疫動物的方法在本領域是公知的（Kohler和 Milstein, Nature 256:495-7, 1975 ;Brown 等，J Tmmunol 127:539-46, 1981 ;Brown 等，J Biol Chem 255:4980-3, 1980 ;Yeh 等，Proc Natl Acad Sci USA 76:2927-31,1976; Yeh 等，Int J Cancer 29:269-75, 1982 ;Kozbor 等，Immunol Today 4:72,1983 ;Cole 等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. , pp. 77-96, 1985 ； 美國專利號 4,816,567 ;Clackson 等，Nature 352:624-81991 ;Marks 等，Mol Biol 222:581-97, 1991)〇
[0136] 根據本發明的一些實施方案，提供包括表達載體的宿主細胞以及轉基因動物，所 述表達載體包含編碼信號肽的DNA區段、共有H或L區信號序列、和編碼和表達本文所述的 抗CD3 mAb，例如mAb或其分離的mAb片段的DNA區段，所述的轉基因動物具有包括所述分 離的DNA區段和/或表達載體的基因組。
[0137] 本文使用的術語"表達載體"和"重組表達載體"是指包含在宿主細胞中表達重組 多肽所必需的希望的和適合的核酸序列的DNA分子，例如質粒或修飾的病毒。在此使用的 "可操作地連接"是指至少兩個序列的功能性連接。可操作地連接包括在啟動子和第二序 列，例如本發明的核酸之間的連接，其中啟動子序列起始和介導對應于第二序列的DNA序 列的轉錄。
[0138] 可通過表達載體提供多肽轉錄所必需的調節區。基因表達所需的調節區的確切性 質在載體和宿主細胞之間可變化。通常地，啟動子是被需要的，其能夠結合RNA聚合酶并促 進可操作地相關的核酸序列的轉錄。調節區可包括那些涉及轉錄和翻譯起始的5'非編碼 序列，如TATA盒、帽序列、CAAT序列等等。編碼序列的3'非編碼區可含有轉錄終止調節序 列，如終止子和聚腺苷酸化位點。還可提供轉錄起始密碼子（ATG)。設計用于哺乳動物表達 細胞的載體可以包含前導序列，一個常見于H鏈以及一個常見于L鏈，用于使mAb高水平的 表達和分泌。該N-末端肽的信號序列最初合成在由信號識別顆粒（SRP)識別的核糖體上， 所述信號識別顆粒阻止mRNA的翻譯，當核糖體通過信號序列停靠在SEC61易位子時，此時 所述SRP被解離，mRNA翻譯恢復并向ER中提供多肽。因此，信號肽在mAb的合成中可具有 非常關鍵的作用。
[0139] 為了將核酸序列克隆至載體的克隆位點中，在合成核酸時添加了提供合適的相容 的限制位點的連接子或接頭。例如，通過使用以包含希望的限制性酶位點的引物的PCR來 擴增DNA，希望的限制酶位點可被引入DNA片段中。
[0140] PCR的替代方法是使用合成基因。所述方法允許產生人工基因，所述人工基因包括 將在希望物種（例如，CHO細胞或大腸桿菌（E. coli))的宿主細胞中表達的核苷酸的優化 序列。重新設計基因提供了在許多情況下提高基因表達的手段。因為遺傳密碼的冗余，使 重寫開放閱讀框（ORF)容易地成為可能。因此，可在ORF中改變至多~30%的核苷酸并還 產生相同的蛋白。對于300個氨基酸的典型蛋白序列，有編碼相同蛋白的>10150個密碼子 組合。使用優化方法例如將很少使用的密碼子替換為更為常見的密碼子，可導致在表達水 平上顯著的提高。還可包括進一步的優化例如去除RNA二級結構。計算機程序可用于執行 這些和其他同時的優化。充分優化的基因可顯著地提高蛋白表達。因為對原始DNA序列進 行了大量的核苷酸變化，創造新設計的基因的唯一可行的方法是使用基因合成。
[0141] 包括與調節區可操作地關聯的多肽序列的表達構建體可直接引入適當的宿主細 胞中用于表達和產生多肽本身或作為重組融合蛋白。可使用的表達載體包括但不限于質 粒、粘粒、噬菌體、噬菌粒、或修飾的病毒。此類表達載體通常包括用于在適當的宿主細胞中 繁殖所述載體的功能性復制起點、用于插入期望的基因序列的一個或更多個限制性內切核 酸酶位點、和一個或更多個選擇標記。
[0142] 包括根據本發明的表達載體和多肽的重組多核苷酸構建體被轉入合適的原核或 真核宿主細胞中，在其中它能夠復制（例如細菌細胞），并被轉錄。這可通過本領域公知的 方法完成。表達載體與相容的原核或真核宿主細胞一起使用，所述宿主細胞可來源于細菌、 酵母、昆蟲、哺乳動物和人類。
[0143] 關于氨基酸、DNA或RNA序列的本文使用的術語"突變體"或"變體"是指，與野生 型或公開的序列不同，但具有序列同一性的這樣的序列。野生型或公開的序列與突變序列 之間的序列同一性的程度優選地高于約70 %、80 %、90 %、95 %、98 %或更高。
[0144] 本文提及的氨基酸殘基包括由根據本領域公知的慣例的單字母或三字母代表的 天然編碼的氨基酸。在化學合成中，還可使用氨基酸衍生物和D異構體。在化學合成中，可 使用連續性、發散性和收斂性合成方法合成肽序列。
[0145] 在本文可互換使用的術語"蛋白"和"多肽"是指通過肽鍵或修飾肽鍵，即肽的電 子等排物（peptide isosteres)相互連接的氨基酸，并可包含除了 20個基因編碼的氨基酸 之外的修飾氨基酸。多肽可通過天然過程，例如翻譯后加工，或通過本領域公知的化學修飾 技術被修飾。翻譯前或后修飾可在多肽中的任何位置發生，包括肽骨架、氨基酸側鏈和氨基 或羧基末端。應當理解的是，相同類型的修飾可以相同或不同的程度出現在給定的多肽中 的多個位點上。而且，給定的多肽可具有許多類型修飾。
[0146] 多肽和氨基酸的修飾包括乙酰化；酰化；ADP-核糖基化；酰胺化；非肽分子的共 價連接，例如黃素，血紅素部分，核苷酸或核苷酸衍生物，脂質或脂質衍生物，或磷脂酰肌 醇（phosphytidylinositol);交聯環化作用；二硫鍵的形成；去甲基化；共價交聯的形成； 半胱氨酸的形成；焦谷氨酸的形成；甲酰化；γ -羧基化；糖基化；GPI錨形成；羥基化；碘 化；甲基化；豆蔻酰化；氧化；聚乙二醇化；蛋白酶解加工；磷酸化；異戊烯化；外消旋化；硒 化；硫化；和轉移RNA介導的將氨基酸添加至蛋白中例如精氨酸化（參見，例如Creighton TE,Proteins-Structure and Molecular Properties2nd Ed.,W.H.Freeman and Company, New York, 1993 ；Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson，Ed，Academic Press，New York，pp. 1-12, 1983) 〇
[0147] 在本文使用的術語"異源的"是指在自然中被發現不在一起的兩種生物組分。該 組分可以是蛋白或其片段、宿主細胞、基因或控制序列例如啟動子。盡管異源組分在自然中 被發現不在一起，它們可以一起起作用，例如當與基因異源的啟動子可操作地連接到該基 因時。
[0148] 在本文可互換使用的術語"多核苷酸"、"核酸序列"和"核酸"是指任何長度的核 苷酸，無論是核糖核苷酸或脫氧核苷酸的聚合形式，包括但不限于，單、雙、或多鏈DNA或 RNA，基因組DNA，cDNA，DNA-RNA雜合體，或包含嘌呤和嘧啶堿基或其他天然的、化學或生 物化學修飾的，非天然的，或衍生的核苷酸堿基的聚合物。還包括的是包括內含子序列的 mRNA或cDNA(參見，例如Niwa等，Cell 99:691-702,1999)。多核苷酸的骨架可包括糖和 磷酸基團（如典型地發現于RNA或DNA中），或者修飾的或取代的糖或磷酸基團。或者，多 核苷酸的骨架可包括合成亞基的聚合物諸如氨基磷酸酯，并因此可以是寡脫氧核苷氨基磷 酸酯或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物（參見，例如，Peyrottes等，Nucl Acids Res 24:1841-8, 1996 ;Chaturvedi 等，Nucl Acids Res 24:2318-23, 1996)。多核苷酸可包括修 飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物，尿嘧啶，其他的糖，和連接基團例如氟代 核糖（fIuororibose)和硫代基（thioate)，和核苷酸分枝（branches)。核苷酸的序列可被 非核苷酸組分中斷。在聚合后多核苷酸可進一步被修飾，例如通過與標記組分接合，加帽， 用類似物替代一個或更多個天然存在的核苷酸，和用于將多核苷酸附加到蛋白、金屬離子、 標記組分、其他多核苷酸或固體支持物的引入的手段。
[0149] 在本文可互換使用的術語提及特定的多肽或蛋白"的編碼序列"和"的編碼區"是 指在其置于適當的調節序列的控制之下時，轉錄并翻譯成特定的多肽或蛋白的核酸序列。
[0150] 術語"編碼多肽的多核苷酸序列"包括僅包含多肽編碼序列的多核苷酸，以及包括 另外的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。另外的編碼序列的實例包括前導或分泌序列。 非編碼序列或調節序列的實例，例如啟動子、轉錄增強子等等，在本領域是公知的。
[0151] 在本文使用并在本領域中公知的術語"同一性"是通過比較序列確定的兩個或更 多個多肽序列之間或兩個或更多個多核苷酸序列之間的關系。術語"同一性"還指多肽或 多核苷酸序列之間的序列相關性的程度，此情況可以是通過這些序列串之間匹配來確定 的。"同一 1性"和"相似性"可容易地通過已知的方法計算（描述于，例如Computational Molecular Biology, Lesk AM 編,Oxford University Press,New York, 1988 ； Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith DW 編,Academic Press, New York, 1993 ；Computer Analysis of Sequence Data, Part I,Griffin AM 和 Griffin HG 編,Humana Press, New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje G, Academic Press, 1987 ；Sequence Analysis Primer, Gribskov M 和 Devereux J 編，M Stockton Press, New York, 1991 ;Carillo H 和 Lipman D，SIAM J. Applied Math 1988,48:1073)〇
[0152] 設計了確定同一性的優選的方法，在被測試的序列之間提供最大的匹配度。 確定同一性和相似性的方法被編碼在可公眾可獲得的電腦程序中。在兩個序列之間 確定同一性和相似性的優選的程序方法包括，但不限于，GCG程序包（Devereux等， Nucl Acids Res 24:2318-23, 1984)、BLASTP、BLASTN 和 FASTA(Atschul 等，J Molec Biol 215:403-10,1990)。BLAST X程序從NCBI和其他來源中為公眾可獲得（BLAST Manual，Altschul 等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894 ;Altschul 等，J Molec Biol 215:403-10, 1990)。作為例證，具有與參考核苷酸序列具有至少例如95%"同一性"的核苷 酸序列的多核苷酸，預期測試的多核苷酸的核苷酸序列與參考序列在其全長上是相同的。 換句話說，為了獲得具有與參考核苷酸序列至少95%相同的核苷酸序列的多核苷酸，參考 序列中至多5%的核苷酸可被缺失或被另一個核苷酸取代，或在參考序列中的總核苷酸的 至多5%的核苷酸的數量可被插入至參考序列中或從參考序列中缺失。參考序列的這些突 變可發生在參考DNA序列的5'或3'末端位置或在那些末端位置之間的任何地方，單獨地 沿參考序列中核苷酸散布或散布在參考序列中的一個或更多個連續的基團中。類似地，為 了獲得具有與參考氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的多肽，參考序列中至多5%的 氨基酸殘基可被缺失或被另一個氨基酸取代，或在參考序列中的總氨基酸殘基的至多5% 的氨基酸的數量可被插入至參考序列中或從參考序列中缺失。參考序列的這些改變可發生 在參考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或在那些末端位置之間的任何地方，單獨地沿參 考序列中殘基散布或散布在參考序列中的一個或更多個連續的基團中。
[0153] 在兩個核酸或多肽的背景中術語"基本上相同的"，是指當為了最大對應性的比較 和比對時，具有至少70 %、80 %和在一些方面90-95