一種快速鑒定蝦蟹卵母細胞核的透明液的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及水產養殖領域，具體為一種處理蝦蟹卵細胞的方法，以及用于快速觀察蝦蟹卵細胞生發泡的透明液。
【背景技術】
[0002]蝦蟹類甲殼動物是重要的水產養殖品種，卵母細胞的發生主要包括三個時期:增殖期、生長期和成熟期。準確判斷卵母細胞所處的發育期，對于在生產上及時掌握進行人工誘導卵母細胞成熟的時間具有重要實用價值，可以縮短蝦蟹人工輔助育苗的周期，同時也是研宄蝦蟹類卵細胞最后成熟機制必不可少的步驟。
[0003]與其它多黃卵物種相似，蝦蟹卵母細胞在生長期合成和儲備大量的卵黃，以供受精后的胚胎發育之用。其卵母細胞在生長期完成卵黃積累后，進入最后減數分裂成熟階段，此階段卵母細胞生發泡(卵核，細胞核)的位置首先從中央向卵母細胞周圍移動，然后核膜瓦解消失，形成減數分裂相包括紡錘體、染色體的形成等，最終停留在減數分裂中期I，之后才能排卵、受精，因此，可根據卵母細胞生發泡的有無或位置判斷卵母細胞所處的發育時期。
[0004]由于大量卵黃物質的積累，使得蝦蟹卵母細胞的光通透性較弱，因此，用肉眼和解剖鏡都很難直接觀察到生發泡，目前通常只有對蝦蟹卵巢組織進行傳統石蠟切片，通過蘇木精-伊紅染色(HE染色)后觀察卵細胞的生發泡，從而確定卵細胞的發育時期。但是石蠟切片方法需要對卵巢樣品進行固定、漂洗、脫水、浸蠟、包埋、切片、染色等一系列繁瑣的試驗步驟，對于一個操作熟練的實驗人員來說，整個實驗流程也要花費一周左右的時間。另夕卜，由于卵母細胞卵黃較多及卵母細胞膜的存在，在制作切片的過程中還經常會出現由于浸蠟不徹底而導致制片失敗。加之，由于卵母細胞在經歷生長期后體積增大，核質比小，在切片時因為切面未經過細胞核而容易造成卵母細胞生發泡破裂的假象，導致判斷錯誤，從而對生產和科研造成一定的影響。
[0005]前人在對斑馬魚卵子發生進行研宄時，用透明液(甲醇:冰醋酸=3:1)對積累卵黃的卵母細胞進行處理，能夠清晰的觀察到生發泡位置(李書鴻毛，韓文，孫志遠，閆維，陳惠萍，嚴紹頤..斑馬魚卵母細胞的體外成熟及成熟卵的受精發育.生物工程學報.1993 ；04:314-9+96) ?在對其它經濟魚類的卵母細胞發育成熟研宄中，又分別用到了另外兩種透明液:快速透明液和松節醇透明液。其中快速透明液的配方為:95%乙醇85份，40%的甲醛10份，冰醋酸5份。它能夠2-3分鐘內將卵母細胞透明，以觀察其生發泡，但是，處理時間超時將會使生發泡也透明。而松節醇透明液在快速透明卵母細胞的同時也可以長時間的保持生發泡不被透明，其配方為:松節醇25份，50%酒精50份，冰醋酸25份(白遺勝等編著.淡水養殖500問.北京:金盾出版社.2006.06)。
[0006]通過觀察透明液處理的卵母細胞生發泡的位置或有無，確定卵母細胞發育時期的方法快速、簡便，且較HE染色的結果更為準確。但是，由于卵母細胞內積累的卵黃含有多種蛋白質、脂類、糖類等不同的物質，且不同的物種卵黃的組成有很大的不同，所以能有效透明魚類卵母細胞的透明液卻不能透明蝦蟹類生物的卵母細胞。因此需要探索一種適用于透明蝦蟹類卵母細胞的透明液的配方。
【發明內容】
[0007]本發明旨在提供一種能夠用于快速透明蝦蟹卵母細胞的透明液及用這種透明液處理和檢查蝦蟹蝦蟹卵母細胞生發泡的方法。
[0008]本發明的技術方案為，一種用于處理蝦蟹類卵母細胞的透明液，為無水乙醇、冰醋酸和甲醛混合物，其體積比為60:1:30。
[0009]上述透明液可應用于處理蝦蟹類卵母細胞，能有效的透明蝦蟹的卵母細胞，并且在生發泡未破的卵母細胞內能清楚的觀察到一不透明的小斑點。經石蠟切片HE檢測，證實其為卵細胞的生發泡(即細胞核)。因此，上述透明液可用于快速鑒定蝦蟹類卵母細胞生發泡(細胞核)。一種快速鑒定蝦蟹類卵母細胞生發泡的方法，步驟為:將蝦蟹類的卵巢組織置于所述透明液中，振蕩使卵母細胞呈游離狀態，靜置I?60分鐘，查看置于透明液中的游離的卵母細胞中生發泡的狀態。
[0010]優選的，振蕩速度為50?800rpm，振蕩時間為2?20min ;更優選的，，振蕩速度為100?500rpm，振蕩時間為5?15min。
[0011 ] 優選的，靜置時間為I?5分鐘。
[0012]優選的，所述的蝦蟹類為中華絨螯蟹或羅氏沼蝦。蝦蟹類為中華絨螯蟹時，步驟
(I)中，中華絨螯蟹卵母細胞會由紫色或黑色變為橘黃色。
[0013]由于卵母細胞積累的大量卵黃，導致無法直接觀察到蝦蟹類卵母細胞的生發泡，而常規石蠟切片HE染色的方法所需時間長，操作繁瑣，在生產和科研上有一定的局限性。本發明通過選擇透明液的成分，并調整無水乙醇、冰乙酸和甲醛的比例，獲得一種能有效的透明蝦蟹類卵母細胞的透明液。該透明液處理成熟的蝦蟹類卵巢，可獲得透明化的卵母細胞，并且在卵母細胞內發現有一小的、不透明的小斑點，用石蠟切片HE檢測，證實其為卵母細胞的生發泡。這說明該透明液能快速、有效的透明蝦蟹的卵母細胞從而方便觀察其生發泡。本發明的透明液使用方便，鑒定方法簡單快速，鑒定結果準確，將為確定蝦蟹卵細胞發育成熟情況、縮短蝦蟹人工育苗時間及研宄其卵母細胞最后成熟的分子機制提供重要的幫助。
【附圖說明】
[0014]圖1為中華絨螯蟹及羅氏沼蝦未經透明液處理、經透明液處理的卵母細胞，以及中華絨螯蟹及羅氏沼蝦卵巢的石蠟切片結果。各圖片中，卵母細胞的生發泡用箭頭指出。
[0015]其中A和D分別為中華絨螯蟹和羅氏沼蝦未經透明液處理的卵母細胞；B和E分別為中華絨螯蟹及羅氏沼蝦經透明液處理的卵母細胞；(:和F分別為中華絨螯蟹及羅氏沼蝦卵巢的石蠟切片結果。
【具體實施方式】
[0016]材料試劑:中華絨螯蟹和羅氏沼蝦購自上海浦東新區果園農貿市場，其中，中華絨螯蟹體重為90-100g，羅氏沼蝦體重為15-20g。無水乙醇、冰乙酸、甲醛、二甲苯、甲醇等化學試劑，購自國藥集團化學試劑有限公司(上海)。4%多聚甲醛固定液，蘇木精、伊紅染料購自于生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0017]實施例1透明液處理中華絨螯蟹卵母細胞
[0018]1.透明液處理方法:
[0019]1、透明液的配制:取無水乙醇、冰乙酸和甲醛按照60:1:30的體積比配制透明液，現配現用。
[0020]2、卵母細胞透明:將中華絨螯蟹解剖，取100毫克的卵巢組織置于15毫升的離心管中，加入3毫升左右的透明液，迅速劇烈震蕩(100?500rpm)，使卵母細胞呈游