利用擬南芥的抗逆基因AtGST提高植物的抗逆性的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及作物遺傳育種領域，具體涉及一種來源于擬南芥的抗逆相關的基因。
【背景技術】
[0002] 自然界中，由于不同的地理位置、氣候條件以及人類活動等多方面原因，造成了各 種逆境，植物常在不利的環境條件下生長，如干旱、水澇、鹽害、低溫、高溫、病蟲害等。對農 業生產來說，各種逆境是影響作物產量和品質最直接、最重要的因素。因此，加強植物抗性 生理的研宄，探明植物在逆境下的生命活動規律并加以人為調控，培育具有抵抗不良環境 性狀的優良品種，以提高作物的產量和品質，對于獲得農業高產穩產具有重要意義。
[0003]谷胱甘肽S-轉移酶（glutathioneS-transferase，簡稱GST，EC2. 5. 1. 18)是廣 泛分布于植物、動物、鳥類、昆蟲及微生物體內的一組多功能同工酶，其主要功能是催化各 種親電子化合物與還原型谷胱甘肽的巰基偶聯，增加其疏水性而易于穿越細胞膜，分解后 排出體外，從而達到解毒的作用。植物GST分為8類，分別為phi(F)，tau(U)，theta(T)， zata(Z),lambda(L),DHAR,TCH0D和MAPEG。其中，最大的兩類phi(F)和tau(U)為植 物所特有，在植物修復有機化合物，尤其是對除草劑的分解過程中起著至關重要的作用。此 外，在提高植物抗逆性方面也具有重要的作用。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種擬南芥抗逆相關的GST基因。
[0005] 所說的擬南芥抗逆相關基因，是AtGSTU19,它具有SEQIDNol的序列。
[0006] 上述基因編碼的蛋白質，它具有SEQIDN〇2的氨基酸序列。
[0007] 上述基因AtGSTU19能用于植物遺傳轉化，在制備抗逆的轉基因植物中的應用。
[0008] 上述所說的擬南芥抗逆相關基因AtGSTU19,是通過以下方法得到： 1.擬南芥cDNA文庫的構建 本發明將擬南芥種子經2.5% (v/v) 0&((：10)2消毒后種植在黑土 ：蛭石：珍珠巖(1:1:1)混合基質中，22 °C，16 h光照培養生長20 d。選生長健壯的幼苗提取總RNA。以 總RNA為模板，Oligo (dT)為引物，參照全式金生物科技有限公司cDNA合成試劑盒說明 (http ://www. transgen. com. cn)，在AMV反轉錄酶的作用下合成cDNA。
[0009] 2?引物的設計與合成 本發明設計一對引物，引物兩端分別引入和feci的酶切位點。
[0010]AtGSTU19-F: 5'-AAGGATCCATGGCGAACGAGGTGATTCTTC-3' AtGSTU19-R: 5'-AAGAGCTCTTACTCAGGTACAAATTTCTTC-3' 引物由上海生工生物工程技術有限公司合成（http://www.sangon.com)。
[0011] 3.PCR的方法獲得擬南芥抗逆相關基因AtGSTU19片段 本發明的PCR擴增采用大連寶生物工程有限公司（http://takara.com.cn)的PCR試 劑，在50y1的體系中進行PCR反應，反應參數為：94°G預變性1min，94°G變性30s;55 °G退火30s;72 〇G延伸1min;共擴增30個循環，再72 °G延伸10min。經過1.0%的瓊脂 糖凝膠電泳檢測擴增產物為一條約600bp的片段。
[0012] 4.克隆鑒定與序列測定 擴增片段采用愛思進生物技術(杭州）有限公司（http://axygenbio.com)DNA瓊 脂糖凝膠回收試劑盒回收后，克隆到大連寶生物有限公司（http://takara.com.cn)的 pMD-18-SimpleT載體上進行克隆鑒定和序列測定。
[0013] 5?序列分析 本發明通過核苷酸序列測定分析，最終獲得擬南芥抗逆相關基因AtGSTU19,其核苷酸 序列信息如SEQIDNol所示，其氨基酸序列如SEQIDN〇2所示。
[0014] 本發明所述的抗逆基因AtGSTU19能用于植物遺傳轉化，在培育提高抗逆性植物 中的應用。
[0015] 本發明實現的有益效果： 本發明克隆了擬南芥AtGSTU19基因，為了進一步分析該基因在鹽、干旱脅迫中的作用 與功能，我們比較了轉AtGSTU19基因的擬南芥植株和野生型擬南芥植株對鹽、干旱脅迫的 耐受性。結果表明，野生型擬南芥和轉AtGSTU19基因的擬南芥植株在存活率上有明顯的差 異，轉基因植株比野生型植株有明顯的抗鹽、抗干旱能力，這也表明AtGSTU19基因的轉入 提高了擬南芥植株的抗鹽、抗干旱能力。
【附圖說明】
[0016] 圖1:瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA產物。
[0017] 圖2 :瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產物。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合具體實施例對本發明作進一步闡述，但不限制本發明。
[0019] 下述實施例中，所用的試驗材料及其來源包括： 擬南芥的種子經過2.5% (v/v)Ca(C10)2f_毒后種植在黑 土：蛭石：珍珠巖（1:1:1)的混合基質中，22 °C，16h光照培養（16h光照，8h黑暗，冷 光源）生長20d。
[0020] 大腸桿菌coJ7)DH5a由上海市農業科學院生物技術研宄所植物 基因工程研宄室保存。克隆載體PMD-18-SimpleT、各類限制性內切酶、Taq聚合酶、連接 酶、dNTP、10XPCRbuffer和DNAmarker購自寶生物工程大連有限公司。所有的化學試 劑都從美國西格瑪化學公司和上海國藥化學試劑公司購買。
[0021] 下述實施例中常規的基因操作參照分子克隆文獻進行【SambookJ，FretsEF， MannsdesTetal.In:MolecularCloning. 2nded.ColdSpringHarborLaboratory Press? 1989]〇
[0022] 實施例1 擬南芥幼苗RNA的抽提和cDNA合成 (一）試驗方法： 植物總RNA的抽提試劑盒為愛思進生物技術(杭州）有限公司（http://axygenbio. com)產品，反轉錄試劑盒為全式金生物科技有限公司（http://www.transgen.com.cn)產 品，各種限制性內切酶和T4DNALigase購自大連寶生物工程有限公司（http://takara. com.cn) 〇
[0023] 稱取約0. lg植物材料進行總RNA的抽提，具體方法參照上述Axygen公司植物小 樣抽提說明書操作進行，所抽提的總RNA進行cDNA合成，具體方法參照TransGen公司說明 書操作進行第一鏈合成。
[0024](二）試驗結果： 采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA產物的結果見圖1，圖中可見明顯的RNA條帶。
[0025] 實施例2 PCR方法獲得擬南芥抗逆相關基因AtGSTU19基因片段 (一）試驗方法： 本發明設計一對引物（AtGSTU19-F和A