鞍帶石斑魚皮膚組織細胞系及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物細胞系技術領域，具體涉及一種鞍帶石斑魚皮膚組織細胞系及其構建方法。
【背景技術】
[0002]鞍帶石斑魚(Epinephelus Lanceolatus)，又稱龍膽石斑魚，俗稱龍膽，是石斑魚類中體型最大的魚類，有斑王之稱。屬鱸形目，鯧科，石斑魚亞科，石斑魚屬。鞍帶石斑魚是我國一類重要海水養殖經濟魚類，由于其肉質鮮嫩、營養豐富，加之其生長快，適應性強，已成為我國南方海水養殖的重要對象。
[0003]近年來，隨著養殖石斑魚規模的不斷擴大，集約化程度的不斷提高，以及受養殖環境污染、管理技術措施相對滯后等諸多因素的影響，石斑魚的病害也日益嚴重。石斑魚疾病繁多，病原包括病毒、細菌、寄生蟲等，尤其是由虹彩病毒、神經壞死病毒引起的病毒病最為嚴重，一旦暴發就會造成大規模死亡甚至全軍覆沒，每年因其造成的直接經濟損失億元以上，已經成為石斑魚養殖業健康發展的重要制約因素之一。
[0004]查清病毒的感染途徑及病毒與細胞相互作用機理是從根本上預防和解決石斑魚等眾多海洋經濟魚類病毒病的關鍵。細胞系作為一種體外培養系統，因其成本低、可重復性好、條件可控等優點，被廣泛應用于病毒學、免疫學、毒理學、發育生物學、生理學、腫瘤學、基因組學、蛋白組學、遺傳學等領域，尤其是在分離與培養病毒、研宄病毒感染途徑、感染機理以及研制病毒疫苗方面是重要的工具。
[0005]魚類是較低等的脊椎動物，生活在病原更為富集的水環境中。魚類皮膚是機體與外界水環境接觸的門戶，也是阻止病原微生物進入體內的第一道防線。魚類的皮膚發揮了屏障的作用并且可以分泌黏液等抗菌物質。對于大多數魚類而言，并不像陸生脊椎動物一樣皮膚表面存在角質化的死細胞，相反，魚類的表皮幾乎全部由活細胞組成。魚類的皮膚一旦受到化學或機械等損傷后，細菌、病毒或其他病原體就可以快速在魚類開放性傷口內生長或進入體內。如對海水魚類危害較為嚴重的淋巴囊腫病毒，通過皮膚傷口、鰓或消化道入侵機體，在局部增殖，再通過血液循環到達其他靶器官。
[0006]顯然，魚類皮膚組織來源細胞是進行魚類病毒分離、鑒定與繁殖，進而研宄魚類病毒的致病機理、病毒宿主相互作用以及研制疫苗的良好材料。魚類原代細胞系的構建技術目前是一種較為成熟的技術，但是要獲得針對病毒敏感的細胞系仍存著很大的偶然性和困難性，所以構建一株需求魚類細胞系有效的途徑是以數量對質量，即制備大批量的原代細胞株，從而篩選出敏感的細胞系。
【發明內容】
[0007]為了克服現有技術的缺陷，本發明提供一種鞍帶石斑魚皮膚組織細胞系，該鞍帶石斑魚皮膚組織細胞系具有傳代穩定、存活率高的特點。
[0008]為解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下:
[0009]一種鞍帶石斑魚皮膚組織細胞系，該鞍帶石斑魚皮膚組織細胞系的生物學名稱為GGSK，該鞍帶石斑魚皮膚組織細胞系于2015年I月29提交保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為:中國.武漢.武漢大學，郵編:430072，保藏登記入冊編號為CCTCC No:C201515，保藏單位地址:中國.武漢.武漢大學，郵編430072。
[0010]本發明的另一目的在于提供上述鞍帶石斑魚皮膚組織細胞系的構建方法，技術方案如下:
[0011 ] 一種鞍帶石斑魚皮膚組織細胞系的構建方法，該構建方法包括以下步驟:
[0012]I)組織取樣:將鞍帶石斑魚魚體消毒，無菌解剖，取皮膚組織，浸泡于漂洗液；
[0013]2)原代培養:將步驟I)浸泡后的皮膚組織切成1-5_2的小組織塊，將上述小組織塊接種于細胞培養瓶，28°C恒溫于培養瓶壁干貼8-12h，加入培養液，開始組織細胞原代培養;
[0014]3)傳代培養:原代培養細胞長至60-90%匯合度時，用胰酶在室溫下消化，加入培養液進行傳代培養。
[0015]作為優選，包括以下步驟:
[0016]I)組織取樣:將健活鞍帶石斑魚魚體用70-75%醫用酒精進行消毒，置于超凈工作臺中，刮去魚鱗，用滅菌解剖器械取其皮膚組織，浸泡于漂洗液；
[0017]2)原代培養:將步驟I)浸洗后的皮膚組織用漂洗液沖洗，鋒利刀片切至1-5_2的小組織塊，加貼塊培養液浸沒小組織塊；將上述小組織塊接種于細胞培養瓶中，翻轉瓶身28 °C恒溫干貼8-12h，再加入2-3mL原代培養液，28 °C恒溫培養箱開始原代培養，每4_6天更換培養液一次；
[0018]3)傳代培養:原代培養細胞長至60-90%匯合度時，進行原代細胞的傳代；用0.25%胰酶室溫下消化2-3min，加入10_15mL原代培養液吹下貼壁細胞；將細胞懸液接種于2個培養瓶中28°C恒溫培養箱培養，以后每5-7天米用傳代培養液傳代一次。
[0019]作為優選，步驟I)中，所述漂洗液包含基礎培養基、400IU/mL青霉素、400 μ g/mL鏈霉素和800 μ g/mL制霉菌素，pH值7.2-7.4、且該基礎培養基為M199培養液。
[0020]作為優選，步驟2)中，所述貼塊培養液包括基礎培養基、20-30 %胎牛血清、0.04-0.05mM NaCl、400IU/mL 青霉素、400 μ g/mL 鏈霉素，pH 值 7.2-7.4 ;該基礎培養基為MEM或L-15或M199培養基。
[0021]作為優選，步驟2)和步驟3)中，所述原代培養液包括基礎培養基、5-20%胎牛血清、0.04-0.05mM NaCl、400IU/mL 青霉素、400 μ g/mL 鏈霉素以及 10_20ng/mL 表皮生長因子，pH值7.2-7.4 ;該基礎培養基為MEM或L-15或M199培養基。
[0022]作為優選，步驟3)中，所述傳代培養液包括基礎培養基、5-20%胎牛血清、0.04-0.05mM NaCl,400IU/mL 青霉素、400 μ g/mL 鏈霉素以及 0_20ng/mL 表皮生長因子，pH值7.2-7.4 ;該基礎培養基為MEM或L-15或M199培養基。
[0023]作為優選，步驟3)中，第2代至第5代時，傳代培養液中含有15-20%胎牛血清、0.04-0.05mM NaCl,400IU/mL青霉素、400 μ g/mL鏈霉素以及8ng/mL表皮生長因子。
[0024]作為優選，步驟3)中，第5代至15代時，傳代培養液中含有15%胎牛血清、0.04-0.05mM NaCl、100IU/mL青霉素、100 μ g/mL鏈霉素以及4ng/mL表皮生長因子。
[0025]作為優選，步驟3)中，第15代以后，傳代培養液中含有8-10 %胎牛血清、0.04-0.05mM NaClUOOIU/mL青霉素、100 μ g/mL鏈霉素，不含表皮生長因子。
[0026]相比現有技術，本發明的有益效果在于:
[0027]1.本發明以鞍帶石斑魚為對象，成功構建了鞍帶石斑魚皮膚組織細胞系，該細胞系代傳穩定，為分離、鑒定海水魚類病毒及病毒疫苗制備提供重要研宄平臺和實驗材料；
[0028]2.本發明提供的鞍帶石斑魚皮膚組織細胞系的構建方法，采用貼塊法，原代皮膚組織細胞迀出與增殖快；在傳代過程中就其生長階段調節培養液中的成分配比，以適合其傳代生長，提高傳代細胞的增殖性能和存活率，同時降低了培養成本；
[0029]3.本發明構建的鞍帶石斑魚皮膚組織細胞系生長狀態良好，以上皮樣細胞為主要形態，細胞能穩定增殖，目前細胞已傳至近60代；
[0030]4.本發明構建的鞍帶石斑魚皮膚組織細胞系不同代次細胞凍存后復蘇率為73% _88%，復蘇細胞能夠貼壁并生長分裂，并可以正常傳代，細胞形態與增殖能力同凍存前無明顯差異。
[0031]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明。
【附圖說明】
[0032]圖1為鞍帶石斑魚皮膚組織塊迀出細胞(標尺=100 μ m);
[0033]圖2為鞍帶石斑魚皮膚組織第2代皮膚組織細胞(標尺=100 μ m);
[0034]圖3為鞍帶石斑魚皮膚組織第17代皮膚組織細胞(標尺=100 μ m);
[0035]圖4為鞍帶石斑魚皮膚組織第52代皮膚組織細胞(標尺=100 μ m);
[0036]圖5為不同培養基對皮膚組織細胞生長的影響圖；
[0037]圖6為不同胎牛血清濃度對皮膚組織細胞生長的影響圖；
[0038]圖7為第44代皮膚組織細胞中期染色體分裂相；