一種表面錨定人i型金屬硫蛋白的食品級乳酸乳球菌及制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域的基因重組表達技術領域，具體涉及一種表面錨定有人 I型金屬硫蛋白的食品級乳酸乳球菌制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 金屬硫蛋白（Metallothionein,MT)具有非常保守的一級結構和相似的空間結 構，廣泛分布于動物、植物和微生物中，是一類富含半胱氨酸、低分子量（6000~7000道 爾頓）、具有較強結合金屬離子能力的蛋白質（VasakM.Advancesinmetallothionein structureandfunctions.JTraceElemMedBiol, 2005, 119:13 - 17.)。MT具有結合 重金屬、清除自由基、抗福射、抗衰老以及調節微量元素平衡等重要生理功能（YangFet al.High-yieldexpressioninEscherichiacoliofsolublehumanMT2Awithnative functions.ProteinExprPurif，2007, 53:186 - 194.)。目前，MT已成為醫學、生物化學、 分子生物學以及環境保護等科研領域的熱門研究課題。同時由于MT高效的重金屬解毒功 能與安全性，已被廣泛應用于醫療、化妝品、保健品及環保等生產領域。
[0003] 利用重金屬誘導動物可獲得可溶性MT，但產量低且提純步驟復雜繁瑣，導致生 產成本極高，限制了MT的應用。由于MT分子量小，半胱氨酸含量高，在原核體系中表達 易形成包涵體，尚未見用大腸桿菌大量生產可溶性MT的報道（ButtTRetal.Ubiquitin fusionaugmentstheyieldofclonedgeneproductsinEscherichiacoli.ProcNatl AcadSciUSA, 1989, 86:2540-2544)。目前，均采用GST、Sumo等促溶標簽重組表達MT蛋 白(HuangYetal.Expressionandpurificationofglutathionetransferase-small ubiquitin-relatedmodifier-metallothioneinfusionproteinanditsneuronal andhepaticprotectionagainstD-Galactose-inducedoxidativedamageinmouse model,JPET, 2009, 329:469 - 478.)〇
[0004] 乳酸菌（Lacticacidbacteria)是一種人體內的益生菌，被廣泛應用于奶 制品生產，肉、蔬菜、面包的發酵等方面，因此被普遍認為是安全級微生物（Generally RecognizedAsSafe,GRAS;Gi11ilandSE.Healthandnutritionalbenefitsfrom lacticacidbacteria.FEMSMicrobiolRev. 1990, 7 (1-2) : 175-188)。從 20 世紀 80 年 代開始，人們就開始致力于對各種乳酸菌尤其是乳酸乳球菌（Lactococcuslactis)的生 物學特性和分子機制進行研宄。乳酸乳球菌作為表面展示外源蛋白的理想菌株有其獨特 的優勢：首先，其自身分泌的蛋白質少，胞外蛋白酶的活性低，目的蛋白質的表達不會受到 乳酸乳球菌自身蛋白質的影響；其次，抗原性弱，不會產生內毒素，進入人體不會引起強 烈的免疫應答；最后，乳酸乳球菌不在胃腸道內定殖，可以避免因其長期定殖而導致的免 疫耐受（馮金，乳酸乳球菌表面展示技術，生命的化學，2013, 33(1) : 91-95)。因此乳酸乳 球菌現已作為一種食品級表達宿主用于表達和表面展示各種抗原、生長因子以及功能蛋 白(RibeiroLA,etal.ProductionandtargetingoftheBmedhabortusantigenL7/ L12inLactococcuslactis:afirststeptowardsfood-gradelivevaccinesagainst Brucellosis,AppliedandEnvironmentalMicrobiology2002, 68(2) :910_916)。但利用 乳酸菌表達外源基因存在表達量低，重組乳酸菌會引入外源基因，使用抗生素作為篩選標 記會引入抗性基因等一些不容忽視的問題。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種表面錨定有人I型金屬硫蛋白的食品級乳酸乳球菌 制備方法，首次在大腸桿菌中高效表達可以錨定在乳酸乳球菌表面的功能性人I型金屬硫 蛋白（hMT)，細菌破碎后不需經過純化等繁瑣的步驟即可將hMT錨定至食品級乳酸菌表面。
[0006] 同時本發明提供一種錨定hMT后的乳酸乳球菌，該乳酸乳球菌不攜帶任何抗性基 因與外源基因，因此可安全地應用于食品、保健品和化妝品等行業。
[0007] 為能簡單高效地獲得錨定有hMT的乳酸乳球菌，并使其能大規模應用，本發明技 術方案如下：
[0008] -種表面錨定人I型金屬硫蛋白的食品級乳酸乳球菌制備方法，包括如下步驟：
[0009] (1)構建含錨定單元的人I型金屬硫蛋白的重組融合表達載體：
[0010] 通過重置PCR將cA基因與hMT基因拼接，兩基因之間引入linker，N端引入促表 達標簽，得到重組cA-hMT基因；cA基因的核苷酸序列如SEQIDN0:1所示，hMT基因的核苷 酸序列如SEQIDN0:2所示，linker的核苷酸序列如SEQIDN0:3所示；
[0011] (2)將重組cA-hMT基因和表達載體pET21a連接，得到的連接產物pET21a-cA-hMT 轉化至大腸桿菌感受態細胞；
[0012] (3)將步驟（2)得到的工程菌誘導表達重組融合蛋白cA-hMT，收獲菌體后超聲破 碎細胞，上清液直接和乳酸乳球菌孵育，融合蛋白cA-hMT無需純化則錨定至菌體表面。
[0013] 步驟（2)重組蛋白表達時為提高可溶蛋白表達量，還需加入分子伴侶，具體步驟 如下：
[0014] 將步驟（2)所述的連接產物pET21a-cA-hMT和含有分子伴侶的表達載體先后轉化 至大腸桿菌的表達菌株。
[0015] 所述分子伴侶為dnaK，dnaj，grpE，groES和groEL中的一種或兩種以上。
[0016] 除濕菌體可直接錨定外，對所述乳酸乳球菌的濕菌體加醋酸（pH= 1)處理并煮沸 30min，PBS洗滌后再與重組融合蛋白cA-hMT進行錨定，可顯著提高重組融合蛋白錨定至乳 酸菌的效率。
[0017] 步驟（3)誘導工程菌表達重組融合蛋白cA-hMT的步驟如下：
[0018]a.將工程菌接種于含氨芐青霉素和氯霉素的液體LB培養基，于37°C、180rpm振 搖過夜，然后按1:100的比例接種于含有氨芐青霉素、氯霉素、L-阿拉伯糖的液體LB培養 基中，當0D達0. 4~0. 8時加入終濃度為0. 5~1.OmM的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)，于 200rpm，低溫繼續培養12h后收集菌液，離心，去除上清液；
[0019]b.用PBS緩沖液洗滌步驟a所得菌體2次，用細菌裂解液重懸，置于冰浴下超聲破 碎，取超聲后的勻漿物離心，分別收集上清液和包涵體。
[0020] 步驟（3)將融合蛋白cA-hMT銷定到乳酸乳球菌表面的步驟如下：
[0021]將上清液與乳酸乳球菌重懸，室溫靜置lh，9000g離心2min棄上清，沉淀用PBS溶 液洗滌3次，重懸至4°C保存。
[0022] 步驟（3)所述乳酸乳球菌為乳球菌1^1363、]\^1614、11?)230、糞腸球菌？42-2、(《1父 或植物乳桿菌。
[0023] 所述乳酸乳球菌的培養步驟如下：
[0024] 將乳酸乳球菌在GM17液體培養基中培養，30°C厭氧靜置培養至對數生長期晚期 或平臺期，〇D6_Ji3~4,室溫9000g離心5min，收集濕菌體。
[0025] 上述方法制得的表面錨定人I型金屬硫蛋白的食品級乳酸乳球菌可添加于食品、 化妝品和環境保護領域，用于人體重金屬解毒、修復重金屬氧化損傷、金屬離子代謝調節以 及廢水廢氣處理和環境修復。
[0026] 將錨定有hMT的乳酸菌進行Cd2+、Pb2+吸附實驗
[0027] 按步驟3的錨定方式將hMT錨定至乳酸乳球菌后，加入lmL的Cd2+或Pb2+(100yM) 重懸，室溫放置2h，期間充分混勾，使蛋白充分吸附重金屬。8000rpm離心lmin，棄上清，菌 體用PBS洗3次后放入65°C干燥箱干燥12h，得到的干菌體稱重后，用60 %的硝酸過夜徹底 消化。加ddH20稀釋至5mL用于原子吸收光譜測定。
[0028] 本發明與現有技術相比，具有如下優點：
[0029] (1)本發明利用分子伴侶（dnaK或dnaj或grpE或groES或groEL)共表達體系在 大腸桿菌中可融表達hMT重組蛋白，總表達量達176m