一種三價病毒抗體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物抗體免疫技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種三價病毒抗體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]手足口病是一種兒童傳染病，有多種腸道病毒可引起手足口病，最常見的是CoxAie型、EV71型及CoxAlO型。其感染途徑包括消化道，呼吸道及接觸傳播。多發(fā)生于5歲以下兒童，潛伏期多為2?10天，可引起手、足、口腔等部位的皰瘆，少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥。主要的傳播方式是通過空氣飛沫傳播，重癥患兒如果病情發(fā)展快，導(dǎo)致死亡。對于手足口病至今還沒有預(yù)防性疫苗和特效治療藥物。
[0003]抗病毒藥一般在發(fā)病24小時到48小時前使用才是最佳的。而往往我們確診手足口病的時候，都已經(jīng)過了最有效的治療階段，現(xiàn)在也不提倡用抗病毒的藥物。目前無特效藥物及疫苗可治療或預(yù)防該病的發(fā)生。
[0004]目前廣譜抗生素對手足口病原體不具有效果，可能破壞益生菌，長時間使用可能引起菌群失調(diào)，產(chǎn)生耐藥菌；化學(xué)方法對手足口病原體具有破壞微生物結(jié)構(gòu)的特性，但對皮膚黏膜具有刺激作用；物理方法對手足口病原體具有殺滅作用，但對人體皮膚黏膜有傷害。疫苗對特異性病原體具有抑滅和中和的作用，但起效慢。
[0005]現(xiàn)已有二價手足口病病毒卵黃抗體(COXA16型、EV71型)，但對部分地區(qū)流行的CoxA1型手足口病病毒無法產(chǎn)生阻斷及預(yù)防性保護，且制備該抗體的抗原為復(fù)合免疫抗原(既為混合二價抗原后免疫母雞)，其產(chǎn)生單型抗體效價由母雞機體差異而不同，單型抗體保護效果無法保證。
[0006]現(xiàn)有制備卵黃抗體的方法，盡管免疫雞為經(jīng)過挑選、檢查和進行了某些疫病的預(yù)防接種的健康產(chǎn)蛋母雞，仍存在一些雞源性的細菌或/和病毒混存于雞蛋從而進入卵黃抗體中的可能，如大腸桿菌、沙門氏菌、雞減蛋綜合征病毒、雞禽白血病病毒等，從而影響抗體的安全性。目前，一些研宄選用帶有毒性的甲醛、二乙烯胺(BEI)及β-丙內(nèi)酯(BPL)作滅活劑，對卵黃抗體中外源性病毒具有滅活效果，但對卵黃抗體的活性有影響從而影響效應(yīng)的效果。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種能三價抗手足口病病毒，且安全性能較好，使用人群更為廣泛的三價病毒抗體。
[0008]本發(fā)明另一個目的在于提供能三價抗手足口病病毒的病毒抗體的制備方法。
[0009]本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):一種三價病毒抗體，所述三價病毒抗體為三價抗手足口病病毒的雞卵黃抗體，所述三價手足口病病毒包括EV71、COXA10、COXA16。
[0010]三價病毒抗體的制備方法，包括以下步驟:
(1)分別制備病毒EV7l、CoxA10、CoxA16的免疫抗原；
(2)將步驟(I)中獲得的三種免疫抗原分別注入到不同的母雞體內(nèi)； (3)收集免疫母雞下的免疫雞蛋，并對免疫雞蛋的蛋黃進行提取、純化，從而分別獲得三種單型抗體原液；
(4)將獲得三種單型抗體原液按照抗體效價檢測配加穩(wěn)定劑，從而獲得抗三價手足口病病毒的雞卵黃抗體。
[0011]為了更好地實現(xiàn)本發(fā)明中三價病毒抗體的制備，進一步地，所述步驟(I)中，制備相應(yīng)病毒的免疫抗原具體過程為:分別將EV71、CoxAlO及CoxA16手足口病毒株接種于Vero細胞中，并將接種有病毒株的Vero細胞置于33~36°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5~7天，待細胞出現(xiàn)病變時收獲病毒液，根根據(jù)收貨的病毒液確定CCID50具體數(shù)值，使用0.2-0.4%甲醛進行滅活，經(jīng)離心、純化后置于2~8°C的溫度環(huán)境中備用；根據(jù)CCID50結(jié)果，將EV71、CoxA1及CoxA16分別用緩沖液稀釋，分別與等量的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑配制成乳化免疫抗原。
[0012]為了更好地實現(xiàn)本發(fā)明中三價病毒抗體的制備，進一步地，所述步驟(2)中將三種免疫抗原分別注入到不同的母雞體內(nèi)的具體過程為:取健康適齡的產(chǎn)蛋母雞，在產(chǎn)蛋母雞的翅基部三角肌或胸肌等位置用乳化好的免疫抗原進行肌肉、皮下多點注射，以使產(chǎn)蛋母雞產(chǎn)生更好的免疫反應(yīng)；其中首次免疫采用弗氏完全佐劑，其余采用弗氏不完全佐劑；首次免疫28天后免疫第2次，以后每間隔28天免疫一次，每次免疫劑量為0.5~lml/只。
[0013]為了更好地實現(xiàn)本發(fā)明中三價病毒抗體的制備，進一步地，所述步驟(3)中，分離、提純的具體步驟如下:
(3.1)將免疫后收集的雞蛋清洗干凈、破殼，分離蛋清蛋黃，去除蛋清，收集蛋黃稱取重量;
(3.2)將蛋黃按1:6~9比例加入純化水稀釋勻漿，用lmol/L鹽酸溶液調(diào)pH4.8-5.5，并在2~8°C的溫度條件下靜置1~24小時；
(3.3)靜置后的液體進行離心，從而去除沉淀物、取上層清液；
(3.4)將獲取的上層清液中加入10%~35%硫酸銨鹽析，使其充分混勻，之后過夜沉淀； (3.5)沉淀完成后，進行離心脫鹽，取得沉淀制得卵黃抗體粗提物，去除硫酸銨上層清液；
(3.6)獲取的卵黃抗體粗提物用1/150~1/300體積弱酸性緩沖液復(fù)溶，調(diào)節(jié)pH為4.8-5.5，令其充分溶解，并在2~8°C的溫度環(huán)境過夜，之后獲取上層清液；
(3.7)將獲取的上層清液用超濾膜進行超濾；
(3.8)將超濾后的溶液進行病毒滅活；
(3.9)進行滅活后的溶液，取其上層清液，剩余的懸濁液進行離心分離，除去沉淀，獲得的上層清液進行合并，獲得單型抗體原液。
[0014]為了更好地實現(xiàn)本發(fā)明中三價病毒抗體的制備，進一步地，所述病毒抗體的分離、提純步驟中，進行離心的離心參數(shù)為4000~20000r/min。
[0015]為了更好地實現(xiàn)本發(fā)明中三價病毒抗體的制備，進一步地，所述步驟(3.7)中超濾使用的超濾膜的截留相對分子量為50~100kD。
[0016]為了更好地實現(xiàn)本發(fā)明中三價病毒抗體的制備，進一步地，所述步驟(3.8)中超濾后溶液的病毒滅活方法為:將需要病毒滅活的溶液放置在溫度為54~60°C的環(huán)境中，保持8-20小時。
[0017]為了更好地實現(xiàn)本發(fā)明中三價病毒抗體的制備，進一步地，所述步驟(4)中，對獲得三種單型抗體進行效價檢測的方法為細胞法或ELISA法。
[0018]為了更好地實現(xiàn)本發(fā)明中三價病毒抗體的制備，進一步地，所述細胞法檢測三種單型抗體的效價方法為:消化并分散RD細胞，調(diào)節(jié)細胞懸液濃度2 X 105/ml左右，待檢樣品從1:8開始進行倍比稀釋至1:64 JfEV71、CoxA16、CoxAlO型病毒分別稀釋為10TCId50備用，取稀釋的病毒液，按照體積比1:1，分別與稀釋的待檢樣品混勻，接種于96孔板中，置36°C中和2小時；加入濃度為2 X 15個/ml的RD細胞懸液0.1ml，置細胞培養(yǎng)箱中36°C孵育5-7天，顯微鏡下觀察細胞病變；待檢樣品出現(xiàn)100%CPE判為陰性，50%以上細胞出現(xiàn)保護者為陽性；能抑制50%細胞病變的最高稀釋度即為該待檢樣品的中和抗體效價。
[0019]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點及有益效果:
(1)本發(fā)明中的三價病毒抗體可中和三型病毒抗原，保護范圍覆蓋更廣；
(2)本發(fā)明中所述方法通過獲得的單型抗體為低級球蛋白，使配置的三型抗體原液中單型抗體可獨立發(fā)揮抑殺抗原的作用，保證有效主動預(yù)防三型手足口病毒；
(3)本發(fā)明中三價病毒抗體制備的方法獲得的三價病毒抗體，生物活性穩(wěn)定，可較長時間保存，且獲得的三價病毒抗體效價高，擁有更多的抗原結(jié)合位點；
(4)本發(fā)明所述的三價病毒抗體安全性好，不會產(chǎn)生血清交叉反應(yīng)或過敏