寡肽cd10及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于蛋白質領域，特別涉及寡肽及其應用。
【背景技術】
[0002] 寡肽是多肽的一種分類，分子量段一般在1000道爾頓以下，也稱作小肽，一般由 2-6個氨基酸組成。
[0003] 炎癥是具有血管系統的活體組織對損傷因子所發生的防御反應。對機體的損傷的 局部組織所呈現的反應稱為炎癥反應，炎癥發展后期會產生滲出液，滲出物的壓迫和炎癥 介質的作用可引起患者疼痛。現在抗炎的臨床應用藥物主要為化學合成藥物，如萘丁美 酮、吲哚美辛、吡羅昔康、布洛芬等，這些化學藥物雖然抗炎效果明顯，但不能治本，不能 消除致炎的基本原因，大多都有較嚴重的不良反應，給患者造成痛苦和損失。
[0004] 創面修復，創面是正常皮膚(組織）在外界致傷因子如外科手術、外力、熱、電流、化 學物質、低溫以及機體內在因素如局部血液供應障礙等作用下所導致的損害。常伴有皮膚 完整性的破壞以及一定量正常組織的丟失，同時，皮膚的正常功能受損。也稱為傷口或者創 傷。創面修復既傷口修復。
[0005] 消化道潰瘍病，胃潰瘍、十二指腸潰瘍統稱為消化道潰瘍病。由于生活節奏加快， 工作壓力加大，近年消化道潰瘍病的發病率不僅未見下降，反有上升趨勢。近10多年來本 病的癥狀也變得不典型，無規律的胃部隱痛常引不起人們的注意，直到發生嘔血或黑便時 方到醫院就診。消化性潰瘍主要指發生在胃和十二指腸的慢性潰瘍，亦可發生于食管下段、 胃空腸吻合口周圍及含有異位胃粘膜的美克爾（MECKEL)憩室。這些潰瘍的形成與胃酸和 胃蛋白酶的消化作用有關，故稱消化性潰瘍。近年研究發現潰瘍的形成與幽門螺旋桿菌（H P)的存在有關。本病絕大多數（95%以上)位于胃和十二指腸，故又稱胃十二指腸潰瘍。本 病的總發病率占人口的5-10%，十二指腸潰瘍較胃潰瘍多見，以青壯年多發，男多于女，兒 童亦可發病，老年患者所占比例亦逐年有所增。由于復發率很高，給患者帶來痛苦。
[0006] 免疫力是人體自身的防御機制，是人體識別和消滅外來侵入的任何異物(病毒、細 菌等）；處理衰老、損傷、死亡、變性的自身細胞以及識別和處理體內突變細胞和病毒感染細 胞的能力。現代免疫學認為，免疫力是人體識別和排除"異己"的生理反應。年老體弱的人 員由于自身免疫系統較弱，所以需要提高細胞的識別能力。免疫力低下是會造成人體容易 受到外界的感染，功能下降。
【發明內容】
[0007]為了尋找一種可以多角度保護人體創面和抗炎鎮痛，同時提高人體免機能的藥 物，發明人通過大量合成試驗，廣泛的篩選，采用Fmoc保護的氨基酸來合成，得到大量寡肽 分子，其中部分寡肽分子獲得了意想不到的技術效果。意外地發現寡肽CD10治療效果較 好：寡肽⑶10由E、H、Y3個氨基酸殘基組成，分子量為447.45Da，其氨基酸序列如SEQID:1 所示。
[0008] 上述寡肽的制備方法可以使用合成，也可以采用從生物體中提取純化得到。寡肽 的制備方法，其特征在于包括如下的步驟：
[0009]a.合成順序為從C端到N端；取1倍摩爾當量的樹脂放入多肽合成儀反應器中， 加入DCM(二氯甲烷）溶脹半小時，然后抽掉DCM，加入序列中第一個Fmoc保護的氨基酸 10mmol，2倍摩爾當量的DIEA(二異丙基乙胺），適量的DMF(二甲基甲酰胺）、DCM溶液(適 量是指以可使樹脂充分鼓動起來為宜)，用氮氣鼓泡反應60min;然后加入約5倍摩爾當量 甲醇，反應半小時，抽掉反應液，用DMF、甲醇洗凈；
[0010]b.加入適量哌啶去除Fmoc(9-芴甲氧羰基）保護基，洗凈，茚三酮檢測；
[0011] c.往反應器中加入序列中第二個氨基酸（也為2倍摩爾當量)，2倍摩爾當量HBTU(苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基脲六氟磷酸鹽）及DIEA，氮氣鼓泡反應半小時，抽掉液體， 用DMF，甲醇洗凈，茚三酮檢測；
[0012]d.重復依步驟b、c的方式依次加入序列中氨基酸，抽掉液體，用DMF洗凈，茚三酮 檢測；
[0013]e.將樹脂用氮氣吹干后，從反應柱中取下并稱取重量，倒入燒瓶中，然后往燒瓶中 加一定量的95%TFA(三氟乙酸)切割液，震蕩反應2h，目的是將多肽從樹脂載體上裂解下來 并去除氨基酸的側鏈保護基團；
[0014]f.濾掉樹脂，得到濾液，然后向濾液中加入大量乙醚，析出粗產物，然后離心，清洗 即可得到該序列的粗產物；
[0015] g.分析提純和質譜檢測：用ESI(電噴霧電離)離子源質譜儀和測序儀檢測該序列 的正確性，用高效液相色譜將粗品提純至要求純度；
[0016] h.收集純化好的目標寡肽溶液放入凍干機中進行濃縮，凍干成白色粉末。
[0017] 本發明提供的寡肽可作為普通食品、保健品或者藥品的組成部分。本發明還提供 一種寡肽的組合物，其中含有藥學可以接受的載體。組合物可以以藥物制劑形式存在，優選 的是注射劑，更優選的是冷凍干燥注射劑，該藥物制劑形式藥物組合物，可以按照制劑學常 規技術制備，包括將藥物活性成分，本發明的寡肽與藥物載體混合，按照制劑學常規技術制 成所需要的劑型。
[0018] 本發明中的寡肽，分子量小、人工合成方便、純度很高，生產方面，適合大規模生 產，在應用方面，這些寡肽抗炎鎮痛效果明顯，對創面損傷、燒傷、燙傷、消化道潰瘍具有顯 著的治療效果；該寡肽還有能提高動物免疫機能的作用，寡肽能夠在制備抗菌、抗炎鎮痛、 抗腫瘤和提高免疫力的藥物中的應用。
【具體實施方式】
[0019] 以下是結合具體試驗對本發明的說明，并不是對本發明保護范圍的限制。實施例 1本發明中寡肽的制備方法
[0020]原料：樹脂（WangResin),Fmoc保護的氨基酸，
[0021] 試劑：N,N-二甲基酰胺（DMF)，DCM，ME0H，乙酸酐，吡啶，DIEA，HBTU，六氫吡啶
[0022] 儀器：十二通道半自動多肽合成儀，高效液相色譜（HPLC)，型號：Waters2695檢測 試劑：苯酚試劑，吡啶，茚三酮試劑
[0023] (1)合成順序為從C端到N端。
[0024] (2)取lOmmol當量的樹