遺傳性視神經病變基因檢測方法、基因芯片和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生命科學與生物技術領域，具體涉及遺傳性視神經病變基因 SNP檢測 固相芯片、探針以及相關的檢測試劑盒。本發明主要提供了 ：（1)提供遺傳性視神經疾病基 因 SNP檢測芯片，該芯片包括針對13個線粒體基因的46個SNP位點的的117條探針系列； (2)提供檢測SNP位點的探針的制備引物；（3)提供一種用于眼科疾病相關基因 SNP檢測的 試劑盒；(4)提供了更全面檢測遺傳性視神經病變基因的SNP位點的方法。
【背景技術】
[0002] Leber 遺傳性視神經病變（Leber，s Hereditary Optic Neuropathy，LHON，簡稱 Leber氏病）是一種母系遺傳性視神經病變，主要累及視網膜、鞏膜篩板前部視乳頭黃斑束 纖維，導致視神經退行性變的母系遺傳病，嚴重的影響著人們正常的生產、生活。根據國家 衛生部（http://www. moh. gov. cn/)最新數據統計我國現有的低視力人口約有710萬，盲人 約有500萬，占總人數的0. 4%，成為世界上視力損傷最嚴重的國家之一。其中，由視神經病 變引起的約為55萬。目前已報道40多種線粒體DNA突變位點與LHON致病相關（http:// WWW. mitomap. org/)，其中90%以上的LHON的家系是由氧化磷酸化復合物I亞基上的ND4 G11778A、ND1 G3460A和ND6 T14484C這3個原發突變位點所致。除上述3個原發性突變 位點外，還有近50個線粒體DNA突變與LHON相關，與線粒體相關的原發性Leber氏病在早 期臨床癥狀不明顯，早期的檢查常常會因此被耽誤，尤其在我國偏遠農村地區，這種情況普 遍存在。因此，在高危人群和易感人群中開展mtDNA突變篩查，對于預防和控制與線粒體相 關的原發性Leber氏病的發生有著極其重要的作用。
[0003] 自發現與mtDNA突變相關的疾病以來，檢測線粒體突變位點的檢測方法主要還是 序列測定。直接測序法是鑒定突變的黃金標準，但該操作繁瑣，費用昂貴限制了它的廣泛應 用。
[0004] 近年來，國內相繼報道了 Leber遺傳性視神經病變的基因診斷試劑盒及其檢測 方法，以滿足對線粒體突變突變進行廣泛篩查的需要，如福建醫科大學于2005年申請了 的基因診斷試劑盒及其檢測方法專利（專利號：200510006097. 8)，該發明是根據90%以 上的Leber氏遺傳性視神經病變患者的線粒體DNA突變屬于3個原發性致病位點突變 (G11778A、G3460A和T14484C)，設計和合成位點特異性PCR引物，直接以全血樣作PCR的 DNA模板，利用等位基因特異性多重PCR技術，單管一次性PCR反應，同時檢測LHON患者的 線粒體DNA的3個原發性致病突變位點，具有簡便快速、高效、費用低、特異性好、只需微量 血液樣本等優點，為LHON患者的快速臨床基因診斷提供一種簡易、可靠的方法和試劑盒， 具有巨大的普及推廣應用價值。但是該方法存在血液中直接PCR擴增的難度加大，實驗中 采取的多重PCR的條件要求將會增加，檢測方法跟普通的方法沒有本質的區別。2006年 杭州優思達生物科技有限公司建立一種以單核苷酸多態性核酸試紙快速檢測LHON線粒體 DNA中G11778A位點突變的新方法（專利號：200610003429. 1)。在應用單核苷酸多態性核 酸檢測試紙條進行多態位點或突變位點的檢測時，需要設計一條特異性延伸引物，這條引 物的3'端堿基緊臨多態性堿基或突變堿基，其在DNA聚合酶的作用下開始延伸，帶有抗 原標記與模板對應的雙脫氧單核苷酸（ddNTP)被連接到延伸引物上。雖然該方法能夠實現 短時間內的檢測陽性位點，但PCR擴增條件嚴格，存在假陰性的幾率大大增加。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是針對目前檢測線粒體DNA突變位點的方法所存在的缺點，提供一 種具有快速、高通量特點的試劑盒，能更好的有利于該疾病的早期診斷與治療的遺傳性視 神經病變基因 SNP檢測。
[0006] 本發明提供的試劑盒，由視神經病變基因 SNP檢測的固相基因芯片、多重PCR所 需要的探針組分、多重PCR反應液、該試劑盒雜交液與洗脫液成分構成。其中，視神經病變 基因 SNP檢測的固相基因芯片包括固相載體以及固定于固相載體上的檢測探針（21個堿 基，表1)，檢測探針具有如SEQ ID No :1_117所不的序列，固相載體可以娃片或玻片等材質 (但不限定于上述材質），表面用氨基或者醛基修飾；多重PCR所需要的探針包括多重PCR 引物，具有如SEQ ID No :118-133所示的序列：樣本前向引物I :ACAGGGTTTGTTAAGATGGC AGA(ID:SEQ118),反向引物 1:GACTAGTTCGGACTCCCC TTC G(ID:SEQ119);前向引物 2:CC CCTTCGCCCTATTCTTCAT(ID:SEQ120)，反向引物 2 :GGTGCCTTGGGTAACCTCTG G(ID:SEQ121); 前向引物 3 :CTACTCAACTTAAACTCCAGCACCA(ID:SEQ122)，反向引物 3 :AGGGGAGATAGGTAGGA GTAGCGT (ID: SEQ123);前向引物 4 :ACCTACTCATGCACCTAATTGGA AG (ID: SEQ124)，反向引物 4 :TATTAGTTGGCGGATGAAGCAGA(ID:SEQ125);前向引物 5 :GATACTGGCAITTTGTAGATGTGGT(I D: SEQ126)，反向引物 5 :TTTTTGGAAAGTCATGTCAGTGG (ID: SEQ127);前向引物 6 :TTATCCAGT GAACCACTATCACGAA(ID:SEQ128)，反向引物 6 :ACGTGGTTACTAGCACAGAGAGTTC(ID:SEQ129); 前向引物 7 :CTTACGACCCCTTATTTACCGAGA(ID:SEQ130)，反向引物 7 :GTGAGGCTTGGATTAGCG TTTAGA(ID:SEQ131);前向引物 8 :TCCTAGCAGCAGCAGGCAAAT(ID:SEQ132)，反向引物 8 :CT CGGGGGAATAGGTTATGTGA(ID:SEQ133)。多重 PCR 反應液，包括 Phusion 等高保證酶 2U/uL、 Phusion 反應 buffer、dATP 100mM，dTTP IOOmM, dGTP IOOmM, dCTPlOOmM、Cy3-dCTP 10mM、 Primer Mix、10 μ M、PCR純化磁珠和無水乙醇；該試劑盒雜交液與洗脫液成分包括雜交液： 6XSSPE，25%甲酰胺，PH6·6to6·8、洗脫液 ：3XSSPE，12·5%甲酰胺，10%SDS，PH6·6to 6. 8、封閉液：6XSSPE，25%甲酰胺，BSA(0. lmg/ml)，PH 6. 6to 6. 8。所采用的該試劑盒的陽 性對照為人的GADPH基因和β-globin基因，其擴增引物序列以及對應探針如下所示，其中 此兩對引物與待檢測的遺傳性視神經病變基因：GADPH前向引物GAAGGTCGGAGTCAACGGATT， GADPH 反向引物 CCTGGAAGATGGTGATGGGAT，GADPH 探針序列 GCCATCAATGACCCCTTCATT、 GCCATCAATCACCCCTTCATT ; β -globin 前向引物 GTGGATGAAGTT GGTGG TGAGG，β -globin 反向引物 CCAGITTAGTAGTTGGACTTAGGGA，β-globin 探針序列 CTGGACAAC CTCAAGGGCACC、 CTGGACAAGCTCAAGGGCACC 〇
[0007] 本發明的另一個目的是提供一種檢測遺傳性視神經病變基因 SNP的固相基因芯 片，該芯片具有針對13個線粒體基因46個SNP位點的如SEQ ID No :1-117所示的序列。該 芯片包括針對13個線粒體基因的46個SNP位點的，可以彌補檢測位點較少，所帶來的漏診 現象，更好的有利于視神經病變的篩查，具有快速高通量的特點。視神經病變基因 SNP檢測 的固相芯片，所述的遺傳性病變基因具有多個突變SNP位點，每個突變SNP位點根據其SNP 突變位點以及相鄰突變的堿基位點情況