檢測kras基因突變的試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及檢測kras基因突變的試劑盒，該涉及利用該 試劑盒在非疾病診斷中檢測kras基因突變的方法。
【背景技術】
[0002] Kras基因為Ras基因家族中的一員，編碼的Ras蛋白P21具有GTP水解酶活性，是 人類表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)依賴的下游信號轉導 通路Ras-Raf-MPK途徑中的重要成員。Kras基因突變導致P21蛋白與GTP牢固結合，持 續激活傳導通路的級聯反應，刺激細胞生長、增殖、分化引起癌變。據報道，Kras基因的突 變率約占結直腸癌總體患者的30% -60%。在這些突變中，80 % -90 %的突變熱點主要位 于KRAS基因的2號外顯子的密碼子12位和13位上，包括7中突變類型：G13D、G12D、G12A、 G12V、G12S、G12R、G12C〇
[0003] 作為信號轉導通路Ras-Raf-MAPK途徑中的上游信號分子，EGFR在60-80 %的結直 腸癌中過度表達。以EGFR為靶點的藥物，可阻斷EGFR信號傳導，從而抑制腫瘤新生血管形 成、腫瘤的生長、侵襲和轉移。但該類藥物只能對Kras基因野生型的結直腸癌患者有效，使 病人的預后得到改善。由于突變型的P21蛋白無需接收EGFR信號，能夠自動活化該通路并 啟動下游信號的轉導。因此，Kras基因野生型的患者能從抗EGFR的藥物中獲益，突變型患 者則不行。Kras基因突變狀態與預測腫瘤患者應用靶向藥物的有效性以及更好的進行個體 化治療中起著重要作用。美國國家癌癥綜合治療聯盟（National Comprehensive Cancer Network，NCCN)《結直腸癌臨床實踐指南》明確指出：（1)所有轉移性結直腸癌患者都應檢 測Kras基因狀態；（2)只有Kras野生型患者才建議接受EGFR抑制劑（如愛必妥和帕尼單 抗）治療。
[0004] 因此，檢測組織或血漿中Kras基因突變對于指導腸癌等癌癥患者臨床用藥，具有 重要的參考價值。
[0005] 目前檢測基因突變的方法主要有以下幾種：
[0006] (1)直接測序法，其原理是：首先針對突變位點設計探針（每個基因設計一對探 針，探針所對應的產物盡可能的包含突變位點所在的位置），然后通過簡單PCR擴增獲得目 的基因產物，最后對PCR產物進行測序并且對測序結果進行初步分析。初步分析完成后，對 一些可能的突變樣品的PCR產物，需要對目的條帶進行切膠回收；回收后的PCR產物連接 克隆載體；挑選陽性克隆測序并對測序結果進行分析。此過程比較繁瑣、耗時長，而且由于 測序方法本身的限制導致其靈敏度不高，只能對含量大于20%的基因突變進行檢測。因此， 此法不適合在臨床中的應用與大量的臨床樣本分析。
[0007] ⑵變性高效液相色譜法（denaturing high-performance liquid chromatograph，DHPLC)。該方法的原理是基于發生錯配的雜合雙鏈DNA與完全匹配的純合 雙鏈DNA解鏈特征的差異將他們分離開。由于雜合雙鏈在突變位點處出現錯配，更易于形 成"Y"形結構，與固定相的結合能力降低，因此雜合DNA鏈要比純合DNA鏈優先洗脫出來， 通過洗脫峰的不同判斷有無突變存在。DHPLC可檢測出含有單個檢測的突變、插入或者缺失 的異源雙鏈片段。該法對已知和未知的突變位點均可以檢測，敏感性在5%左右，但檢測過 程中需要打開反應管，容易造成污染，而且陽性結果不能確認其具體未知，最終還需測序確 認。
[0008] (3)高分辨率溶解曲線（high resolution melting，HRM)。高分辨率溶解曲線是 基于核酸的物理性質，通過飽和染料結合于PCR擴增產物，監控產物熔解曲線的變化分析 基因突變。檢測敏感性在5%左右，對于陽性結果并不能確定其具體位置，最終還需要通過 測序加以確認。
[0009] (4)探針擴增阻滯突變法（amplification refractory mutation system，ARMS)。 利用PCR探針的3'端末位堿基必須與其模板DNA互補才能有效擴增的原理，設計針對突變 位點的特異性PCR擴增探針，在嚴格的條件下，只有在探針3'堿基與模板配對時PCR擴增 反應才能正常進行，從而檢測出突變。通過設計兩個5'端探針，一個與正常DNA互補，一個 與突變DNA互補，對于純和性突變，分別加入兩種探針及3'端探針進行兩個平行的PCR，結 合有與突變DNA完全互補的探針才可以延伸并得到PCR擴增產物。
[0010] (5)等位基因特異的Taqman聚合酶鏈式反應（competitive allele-specific TaqMan polymerase chain reaction，CAST-PCR)。CAST-PCR 法米用優化 TaqMan 探針，通 過一段特異設計的MGB探針來阻止探針與野生型DNA結合，選擇性的優先擴增突變型DNA， 該檢測方法的靈敏度在1 %左右。
[0011] 因此，急需一種提高檢測kras基因的靈敏度的方法和相應的檢測試劑盒，為腸癌 個體化用藥提供指導。
【發明內容】
[0012] 有鑒于此，本發明的目的在于提供檢測kras基因突變的試劑盒，該試劑盒特異性 強且靈敏度高；本發明的目的之二在于提供檢測kras基因突變方法，該方法檢測周期短。
[0013] 為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：
[0014] 檢測kras基因突變的試劑盒，所述試劑盒含有針對kras基因突變位點的LNA鎖 核酸修飾的特異探針。
[0015] 優選的，所述鎖核酸修飾的特異探針的核苷酸序列為 GG+AGCT+G+GTG+GCGTAGGC_P04，其中" + "后的A或G為鎖核酸修飾堿基。
[0016] 優選的，所述試劑盒中還包含檢測Kras基因突變的引物，所述引物的核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 1 與 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 2 與 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 3 與 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 4 與 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 5 與 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 6 與 SEQ ID NO. 8 或 SEQ ID NO. 7 與 SEQ ID NO. 8 所示。
[0017] 優選的，所述試劑盒中還包括PCR緩沖液、dNTPs、Eva Green和二氯化鎂。
[0018] 優選的，所述試劑盒中各組分的終濃度如下：1XPCR buffer、2. 5mM MgCl2、dNTP 250 μ M、引物 250nM、探針 500nM、I X EVE GREEN、DNA 聚合酶 IU 和 DNA 模板 2-20ng。
[0019] 2、所述檢測kras基因突變的試劑盒在非疾病診斷中檢測kras基因突變的方法， 包括如下步驟：
[0020] a.設計檢測kras基因突變的引物和針對kras基因突變位點的LNA鎖核酸修飾的 特異探針；
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