索托帕拉雅病毒的實時熒光pcr檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及病毒檢測領域，具體而言，涉及駒鼯科中攜帶的索托帕拉雅病毒的實 時熒光RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 索托帕拉雅病毒（Thottapalayam virus, TPMV)屬于布尼亞病毒科的漢坦病毒屬， 為有包膜分節段的單股負鏈RNA病毒，基因組由S、M、L三個基因片段組成，分別編碼核蛋 白、Gl和G2表面糖蛋白及RNA聚合酶，其中S基因大小為1530nt，核蛋白為430aa ;M基因 大小為3621nt，糖蛋白為1122aa ;L基因大小為6575nt，RNA聚合酶為2150aa。該病毒由 Carey DE等人于1964年在印度的索托帕拉雅地區分布的_黯科的臭_黯中發現，第一次 發現漢坦病毒可以由食蟲目動物攜帶。
[0003] 雖然索托帕拉雅病毒在分類學上屬于漢坦病毒，但分析發現，與嚙齒目動物中 分離的漢坦病毒差異性較大，如索托帕拉雅病毒S基因與漢灘病毒的核苷酸同源性為 47. 9%，編碼的氨基酸同源性為47. 1 %;與漢城病毒的核苷酸同源性為40. 8%，氨基酸同源 性為45. 7% ;與普馬拉病毒的核苷酸同源性為43. 7%，氨基酸同源性為44. 6%。同時，系 統發生分析發現，索托帕拉雅病毒與嗤齒目動物中分尚的病毒在進化關系上比較遠，分屬 兩個不同的進化分枝。根據漢坦病毒的分類標準，確定索托帕拉雅病毒為新種。
[0004] 近年來，隨著對自然疫源地小哺乳動物特別是食蟲目駒鼯科的深入研宄，越來越 多的物種中檢測到漢坦病毒新種，如短尾駒中分離的梁河病毒，東北駒鼯中分離出的牙克 石病毒，加納麝_中Tanganya virus，正大麝_中Imjin virus，CBNV等。這些病毒與索托 帕拉雅病毒的同源性非常高，從分子進化上看，駒鼯科分離出的病毒在進化關系上更為接 近，共同聚集在單獨的一進化枝上，并與嚙齒目動物中分離的病毒進化分歧較大，分在兩個 進化簇內。
[0005] 目前，由嚙齒動物攜帶的漢坦病毒可以感染人，如歐亞地區流行的普馬拉病毒、薩 累瑪病毒、漢灘病毒及漢城病毒引起腎綜合征出血熱，北美洲流行的辛諾柏病毒、門安派吉 拉病毒及紐約病毒引起漢坦病毒肺綜合征。駒鼯科動物攜帶的漢坦病毒是否感染人，暫時 還沒有相應的病例，但是隨著人日益活動空間的擴大，駒鼯科動物中攜帶的病毒感染人的 機率日益增大，對人的衛生安全存在潛在的威脅。隨著對駒鼯科病原體分子流行病學調查 的不斷深入，索托帕拉雅病毒種類不斷增多，數量日趨增大。截止目前尚未有一種只針對駒 鼯科動物中的索托帕拉雅病毒的快速檢測試劑盒。
[0006] 從現有的資料看，漢坦病毒的發現主要依靠細胞分離技術、免疫熒光技術及巢式 PCR技術來實現。在實際工作中細胞分離技術雖為病毒學的金標準，但在實際工作中耗時 長，特別是在現場快速檢測中無法發揮其特點；免疫熒光技術耗時費力，且存在一定的假陽 性，不利于進行大規模病原體篩查；PCR技術的出現，不但提高了檢測的準確率而且可以擴 增到目的基因，但在漢坦病毒的檢測中應用巢式PCR技術，該技術提高了目的基因擴增的 特異性，但該方法需要進行至少2次PCR，存在污染的風險。
[0007] 近些年來，也發現有新的檢測技術不斷出現，如漢坦病毒群的簡并RT-PCR檢測 法，該法主要針對嚙齒動物中攜帶的不同型別的漢坦病毒，可以實現一次性分型鑒定，但是 絕大部分的漢坦病毒的載量均比較低，尤其是在樣本中，并不能完全檢測到或造成漏檢。同 時，引物的簡并性越高其擴增的靈敏度會降低。
【發明內容】
[0008] 針對現有技術的不足，本發明的一個目的是提供一種索托帕拉雅病毒實時熒光 RT-PCR檢測試劑盒。
[0009] 本發明的另一個目的是提供一種對駒鼯科樣本中索托帕拉雅病毒的實時熒光 RT-PCR檢測試劑盒。
[0010] 本發明的再一個目的是提供索托帕拉雅病毒實時熒光RT-PCR檢測方法。
[0011] 為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：
[0012] 一種索托帕拉雅病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，該試劑盒包含對索托帕拉雅 病毒S基因的一段區域進行特異性檢測所用的引物對和探針，所述引物對和探針的序列如 下SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示，所述探針5 '端連接熒光基團，3 '端 連接淬滅基團。
[0013] 所述熒光基團為FAM、CY3、HEX、VIC中任一種，所述淬滅基團為BHQ1、TAMARA、BHQ2 中任一種。
[0014] 如上所述的檢測試劑盒，優選地，還包括：2 X RT-PCR緩沖液，IOnm的0.0 lnmol/L 的膠體金；25XRT-PCR enzyme Mix。
[0015] 如上所述的檢測試劑盒，優選地，還包括陽性對照，所述陽性對照為含有如SEQ ID No. 7所示序列。
[0016] 一種對駒鼯科樣本中索托帕拉雅病毒的實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，優選地，除 上述試劑外，還包括對駒鼯科動物的細胞色素 b基因的內部質控，所述內部質控包括上、下 引物和探針，所述上、下引物和探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。
[0017] 一種對駒鼯科樣本中索托帕拉雅病毒的實時熒光RT-PCR檢測檢測方法，該方法 包括以下步驟：
[0018] (1)從樣品中提取RNA ;
[0019] (2)對步驟⑴提取的RNA進行實時熒光RT-PCR擴增；其中，RT-PCR擴增時，反應 體系包括：檢測索托帕拉雅病毒和內部質控的上、下游引物和探針，所述檢測索托帕拉雅病 毒的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，所述檢測索托帕拉雅 病毒探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；所述內部質控的上下游引物的核苷酸序列如 SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示，探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示，樣品RNA ;
[0020] (3)收集熒光信號，選擇上述熒光基團的熒光檢測模式，基線調整取3~15個循環 的熒光信號，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線；
[0021] (4)結果判定：待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈現良好的對數增長，則判 斷為陽性，如無典型的擴增曲線，判斷為陰性。
[0022] 如上所述的檢測方法，優選地，所述檢測索托帕拉雅病毒探針的5 '端連接FAM熒 光基團和3 '端連接BHQl猝滅基團；所述內部質控探針的5 '端連接VIC熒光基團和3 ' 端連接TAMARA淬滅基團。
[0023] 如上所述的檢測方法，優選地，所述反應體系中還包括有：IOnm的0.0 lnmol/L的 膠體金，I X RT-PCR 緩沖液；I X RT-PCR enzyme Mix。
[0024] 如上所述的檢測方法，優選地，所述實時熒光RT-PCR擴增的反應條件為：45°C，逆 轉錄3〇!1^11 ;95°〇，預變性1〇1^11;預擴增階段：95°〇，變性1〇86(3,50°〇，退火1586(3,72°〇， 延伸15sec，共進行5個循環；擴增階段 ：95°0，1〇86〇，55°0,4〇86〇，并在55°0時采集熒光信 號，共進行40個循環。
[0025] 如上所述的檢測方法，優選地，所述檢測方法中還包括對陽性對照的檢測，所述陽 性對照的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示。
[0026] 本發明提供一種索托帕拉雅病毒的實時熒光RT-PCR檢測試劑盒。該試劑盒基于 實時熒光定量RT-PCR檢測，設計了一對引物和探針針對駒鼯科樣本中索托帕拉雅病毒進 行實時定性定量檢測，更進一步，為了降低樣本假陰性的檢測機率，試劑盒中設計了一套能 夠特異性鑒定駒鼯科動物的內部對照反應。該反應在實際檢測中可以作為樣本RNA提取成 敗的檢測標準，也可作為樣本陰性