早期矽肺患者血清外泌小體miRNAs檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種職業病檢測篩查試劑盒，特別是涉及一種早期矽肺患者血清外泌 小體miRNAs檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 塵肺病是我國主要的職業病之一，約占職業病總人數的80%。我國矽肺病例占總 病例50%，位居第一，是塵肺中危害最嚴重的一種。目前，矽肺的診斷標準主要依靠影像學， 往往在病人出現明顯癥狀時才能診斷出患有矽肺，這時任何藥物都無法逆轉已發生的肺纖 維化病變。因此，尋找快速簡便的矽肺早期生物標志物，開展二級預防顯得十分必要。
[0003] 生物標志物的選擇條件是快速、簡便和穩定，人體外周血血清非常容易獲取，血清 中外泌小體表達水平不隨溫度、酸堿性、時間而快速變化。外泌小體是由細胞內多泡體與細 胞膜融合后，釋放到細胞外基質中的一種直徑約30~120nm的膜性囊泡，這些膜性外泌 小體在細胞之間穿梭傳遞重要信息，也會進入血液、唾液、尿液及乳汁等體液中，產生遠程 調控作用，實驗證明，B細胞來源的外泌小體通過整合可與細胞外基質中的膠原-I和纖維 結合蛋白相結合，表明體內分泌的外泌小體經與細胞外基質相互連接，減少外泌小體的擴 散，增加局部濃度，從而提高了外泌小體在局部的生理作用。外泌小體內包含有大量的特定 miRNAs和特定蛋白質，帶有大量的特定信息在細胞之間來回傳遞，因此認為選用血清中的 外泌小體miRNAs作為生物標志物是可行的。外泌小體的提取一般采取超速離心或化學提 取法，超速離心法存在提取費時（需48小時）費力和超離設備條件過高，并且由于過高的 轉速對操作者的安全構成威脅。單純化學試劑提取法存在得率偏低等缺陷。miRNAs是在 真核生物中發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，其大小長約20~25個核苷 酸，通過堿基互補配對的方式識別靶mRNAs，并根據互補程度的不同指導沉默復合體降解靶 mRNAs或者阻遏靶mRNAs的翻譯。
[0004] 最近的研宄表明miRNAs參與到矽肺發生發展的各個過程，并且已經研宄發現了 一些特定的miRNAs調控砂肺纖維化的發病機制，比如miR-155、miR_29a。
[0005] 目前，qPCR技術已經成功應用于多種疾病的miRNAs檢測，但尚未見該方法在矽肺 病人血清中的外泌小體miRNAs檢測方面的應用。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種早期矽肺患者血清外泌小體 miRNAs檢測試劑盒。
[0007] 本發明的技術方案概述如下：
[0008] 早期矽肺患者血清外泌小體miRNAs檢測試劑盒，包括：血清分裝管，外泌小體 miRNAs提取試劑盒，外參線蟲miR39試劑，逆轉錄試劑盒，hsa-U6引物，cel-miR-39引物， miRNAs引物試劑盒，qPCR檢測試劑盒，無 RNA酶的EP管，無水乙醇和CldH2O，所述miRNAs引 物試劑盒包括SEQ ID NO. 1所示的miR-16-5p上游引物和SEQ ID NO. 2所示的let-7d-5p 上游引物。
[0009] 本發明的優點：
[0010] 1)本發明的方法可使血清外泌小體的HIiRNAs提取得率高。梯度離心結合化學試 劑提取法可以定量地從體液中提取外泌小體，減少了超高速離心法的危險性和化學法提取 得率偏低的風險，為獲得外泌小體中的miRNAs帶來便利；
[0011] 2)選用的miRNAs在外泌小體中均為高表達。miR-16_5p、let_7d_5p在血清外泌 小體中的表達相對較高，避免了極低表達量難以檢測的缺陷。
[0012] 3)使用本發明的試劑盒鑒定疑似早期矽肺患者具有快速、高效、簡便的特點。擴增 效率高，靈敏度、特異性高，整個檢測反應只需6小時即可完成，操作安全。
[0013] 本發明的方法、體系可以快速高效地檢測到矽肺病人血清中的外泌小體 microRNAs，為檢測篩選疑似早期矽肺患者提供了新的技術平臺，易于推廣應用，具有較大 的經濟、社會效益。
【附圖說明】
[0014] 圖1為早期矽肺患者血清外泌小體miR-16_5p的qPCR溶解曲線。
[0015] 圖2為早期矽肺患者血清外泌小體miR-16_5p的qPCR擴增曲線。
[0016] 圖3為早期矽肺患者血清外泌小體let-7d_5p的qPCR溶解曲線。
[0017] 圖4為早期矽肺患者血清外泌小體let-7d_5p的qPCR擴增曲線。
[0018] 圖5為早期矽肺患者血清外泌小體U6的qPCR擴增曲線。
[0019] 圖6為早期矽肺患者血清外泌小體U6的qPCR溶解曲線。
[0020] 圖7為早期矽肺患者血清外泌小體線蟲miR39的qPCR擴增曲線。
[0021] 圖8為早期矽肺患者血清外泌小體線蟲miR39的qPCR溶解曲線。
[0022] 圖9為早期矽肺患者血清外泌小體miR-155_5p的qPCR擴增曲線。
[0023] 圖10為早期矽肺患者血清外泌小體miR-155_5p的qPCR溶解曲線。
[0024] 圖11為早期砂肺患者血清外泌小體miRNAs診斷ROC曲線。
[0025] 圖12 let7d_5p Δ CT值判定早期矽肺的概率。
[0026] 圖13 miR16的ACT值判定早期矽肺的概率。
[0027] 圖14 let7d_5p和miR16的Δ CT值判定早期矽肺的概率。
【具體實施方式】
[0028] 下述試劑均為商品，其廠商為：
[0029] I. 5ml血清分裝管，購自購自美國Axygen公司；
[0030] 外泌小體 miRNAs 提取試劑盒，內含 ExoQuick、Lysis Buffer、Wash Buffer、 Elution Buffer、SeraMir RNA Columns，均購自美國 SBI (System Biosciences)公司；
[0031] 外參線蟲miR39試劑，購自天根生化科技（北京）有限公司，貨號CRlOO-Ol ;
[0032] 逆轉錄試劑盒，內含.TransScriptli miRNA RT Enzyme Mix、2XTS miRNA Reaction Mix,均購自北京全式金生物技術有限公司；
[0033] hsa_U6引物，購自天根生化科技（北京）有限公司，貨號⑶201-0145 ;
[0034] cel-miR-39引物，購自天根生化科技（北京）有限公司，貨號⑶200-01 ;
[0035] miRNAs引物試劑盒，內含miR-16-5p上游引物；、let-7d-5p上游引物；
[0036] qPCR檢測試劑盒，內含Universal miRNA qPCR Primer (IOuM)、2><TransStartK Top Green
[0037] qPCRSuperMix、Passive Reference Dye (50 X) (Optional)，均購自北京全式金生 物技術有限公司；無 RNA酶的EP管，購自美國GEB (Gene Era Biotech)公司；
[0038] 無水乙醇，購自天津市江天化工技術有限公司；
[0039] ddH20,購自北京全式金生物技術有限公司。
[0040] 下面通過具體實施例對本發明作進一步的說明。
[0041] 實施例1
[0042] 一種早期矽肺患者血清外泌小體miRNAs檢測試劑盒，包括：
[0043] I. 5ml血清分裝管；
[0044] 外泌小體miRNA提取試劑盒，內含ExoQuick、Lysis Buffer、Wash Buffer、Elution Buffei\
[0045] SeraMir RNA Columns ；
[0046] 外參線蟲miR39試劑；
[0047] 逆轉錄試劑盒，內含TransScripl/ miRNA RT Enzyme Mix、2 X TS miRNA Reaction Mix ；
[0048] hsa_U6 引物；
[0049] cel-miR-39 引物；
[0050] miRNAs 引物試劑盒，內含 miR-16_5p、let-7d_5p ;
[0051] qPCR檢測試劑盒，內含Universal miRNA qPCR Primer (IOuM)、2xTransStart^ fTop Green
[0052] qPCRSuperMix、Passive Reference Dye (50X) (Optional);
[0053] 無 RNA酶的EP管；
[0054] 無水乙醇；
[0055] (IdH2O0
[0056] 實施例2
[0057] 使用本發明的試劑盒檢測早期矽肺患者血清外泌小體miRNAs的方法：
[0058] 一.血清樣品采集與處理
[0059] 疑似早期矽肺患者空腹8小時于清晨抽取靜脈血5毫升，不抗凝；30分鐘內放 入4°C冰箱保存；3小時內于4°C 3500rpm離心10分鐘