一種生產β-胡蘿卜素的方法及其基因工程菌的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種生產β -胡蘿卜素的方法及其基因工程 菌。
【背景技術】
[0002] β_胡蘿卜素屬于萜類化合物，是類胡蘿卜素家族中的一員，在食品、藥品、化妝品 和保健品中有著廣泛的應用。
[0003] 目前，β -胡蘿卜素的生產方法有化學合成品的生產及天然品的生產方法，而化學 合成產品全為反式結構，天然品為順式和反式混合型。化學合成以維生素 A合成過程中的 中間體C14醛、維生素 A為原料開始合成，而天然品的產生方法主要是從天然植物、蠶糞、鹽 藻和微生物發酵液中提取。由于人們對β胡蘿卜素藥理活性的要求，天然品逐漸成為一種 趨勢。
[0004] β-胡蘿卜素屬于萜類化合物，合成萜類化合物的內源性途徑主要有甲基赤蘚 糖-4-磷酸（MEP)途徑和甲羥戊酸（MVA)途徑，其中MEP途徑主要存在于植物的質體、細菌 和藻類等，MVA途徑主要存在于真核生物、古細菌和高等植物的細胞液中。這兩類代謝途徑 的終產物均是萜類化合物的共同的前體物質二甲基烯丙基焦磷酸（DMPP)和異戊酰焦磷酸 (ΙΡΡ)，之后在β-胡蘿卜素合成基因存在下合成β-胡蘿卜素。
[0005] 微生物具有生產快、發酵周期短、遺傳背景清晰、易于工程化操作等優點。近年來 隨著合成生物學的不斷發展，人們對利用基因工程生產β-胡蘿卜素進行了廣泛的研究， 主要是針對單個基因進行調控，過表達MEP途徑中的單個基因，來提高β-胡蘿卜素的產 量。但是這些方法操作復雜，菌株穩定性較差。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是針對現有的生產β胡蘿卜素的方法操作復雜，穩定 較低的問題，提供一種生產β_胡蘿卜素的方法及其所用的大腸桿菌基因工程菌。
[0007] 本發明的技術方案之一是：一種生產β -胡蘿卜素的方法，包括以下步驟：培養大 腸桿菌基因工程菌，從發酵液中獲得胡蘿卜素，所述的大腸桿菌基因工程菌是含有外 源的含四個胡蘿卜素合成基因的表達載體的大腸桿菌，該四個胡蘿卜素合成基因 分別是：crtE(櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合成酶基因)、crtB(茄紅素合成酶基因)、crtl(番茄 紅素合成酶基因)和crtY ( β-胡蘿卜素合成酶基因），其中，所述的大腸桿菌基因工程菌還 含有含四個MEP途徑基因的表達載體，該四個MEP途徑基因分別是：dxs(脫氧木酮糖-5-磷 酸合成酶基因 )、idi (異戊酰基焦磷酸異構酶基因 )、ispD (4-二磷酸胞苷甲基-D-赤蘚糖 醇合成酶基因）和ispF (2-甲基-D-赤蘚糖醇-2, 4-環二磷酸合成酶基因）。
[0008] 本發明所述的大腸桿菌基因工程菌的培養方法同常規的大腸桿菌培養方法，包括 接種于LB培養基中進行培養，培養至菌體濃度至誘導濃度時加入誘導劑IPTG，即表達導入 的外源基因，從而產生β-胡蘿卜素。然后從發酵液中獲得β-胡蘿卜素。從發酵液中獲 得β-胡蘿卜素的方法是本領域的常規方法。
[0009] 本發明的技術方案之二是：一種高產β_胡蘿卜素的大腸桿菌基因工程菌，所述 的大腸桿菌基因工程菌是含有外源的含四個胡蘿卜素合成基因的表達載體的大腸桿 菌，該四個β -胡蘿卜素合成基因分別是：crtE、crtB、crtl和crtY，并且，所述的大腸桿菌 基因工程菌還含有含四個MEP途徑基因的表達載體，該四個MEP途徑基因分別是：dxs、i di、 ispD 和 ispF〇
[0010] 本發明所述的大腸桿菌基因工程菌含有含四個MEP途徑基因的表達載體。大腸桿 菌原基因組中含有上述四基因，通過外源的該四基因的導入，增加大腸桿菌上述四基因的 拷貝數。
[0011] 本發明所述的含四個MEP途徑基因的表達載體，能夠在大腸桿菌中表達該四基 因。較佳的，所述的含四個MEP途徑基因的表達載體的載體骨架是質粒pTrcHis2B或者質粒 pET32a(+)，更佳的是質粒pTrcHis2B。質粒pTrcHis2B的啟動子是trc，pET32a(+)的啟動 子的是17,其中trc是弱啟動子，T7是強啟動子。一般而言，強啟動子有利于重組蛋白的表 達，可能有利于產物的產生，弱啟動子不利于重組蛋白的表達，也就不利于產物的產生。本 發明在做了多次重復試驗后，發現pTrcHi S2B中的的啟動子trc雖然是弱啟動子，但是相比 于pET32a(+)的強啟動子T7,更加利于β-胡蘿卜素的產生。
[0012] 本發明中，所述的含四個β-胡蘿卜素合成基因的表達載體含有四個β-胡蘿卜 素合成基因：crtE、crtI、CrtB和CrtY。較佳的，所述的表達載體含有包括該四基因的β-胡 蘿卜素合成基因簇。優選的是本領域常規的β_胡蘿卜素合成基因簇，更優選來自成團泛 菌CGMCC NO. 1. 2244的β -胡蘿卜素合成基因簇。如本領域常規，β -胡蘿卜素合成基因 簇也稱為crt基因簇，包含的基因有crtE、crtl、crtB和crtY。
[0013] 本發明所述的含四個β-胡蘿卜素合成基因的表達載體能夠在大腸桿菌中表達 該四基因。較佳的所述的含四個β-胡蘿卜素合成基因的表達載體是質粒pACYC184-M-crt (參見文獻：趙婧，劉怡，李清艷等.多個調控元件調控萜類合成途徑基因表達提高β-胡 蘿卜素的生產[J].生物工程學報，2013, 29(1) :41-55.)。
[0014] 采用上述兩個表達載體轉化大腸桿菌即獲得所述的大腸桿菌基因工程菌。所述的 轉化的方法是常規的，采用常規方法轉化大腸桿菌感受態細胞即可。
[0015] 本發明所述的大腸桿菌是本領域常規的表達外源基因的宿主微生物，優選大腸桿 菌 BL21 (DE3)。
[0016] 所述的大腸桿菌基因工程菌的一較佳構建方法包括：
[0017] (1)上游質粒 pET32a(+)-dxs-idi_ispDF 構建：
[0018] ①以大腸桿菌基因組為模板，根據載體pET32a(+)設計的酶切位點，通過PCR獲得 目的片段dxs、idi和ispDF ;
[0019] ②利用酶切連接的方法，將目的片段dxs、idi和ispDF導入載體pET32a(+)中，從 而構建上游質粒 pET32a(+)-dxs-idi_ispDF ;
[0020] (2)上游質粒 pTrcHis2B-dxs-idi_ispDF 構建：
[0021] ①以大腸桿菌基因組為模板，根據載體pTrCHis2B設計酶切位點，通過PCR獲得目 的片段 dxs、idi 和 ispDF ;
[0022] ②利用酶切連接的方法，將目的片段dxs、idi和ispDF導入載體pTrcHis2B中，從 而構建上游質粒 pTrcHis2B-dxs-idi_ispDF ;
[0023] (3)下游質粒 pACYC184-M-crt 構建：
[0024] 下游質粒pACYC184-M_crt為已知的，參見文獻：趙婧，劉怡，李清艷等.多 個調控元件調控萜類合成途徑基因表達提高β_胡蘿卜素的生產[J].生物工程學 報，2013, 29(1) :41-55。質粒pACYC184-M-crt具體構建方法包括：以成團泛菌CGMCC NO. 1.2244基因組為模板，擴增β-胡蘿卜素合成基因簇crtEXYIB，然后連接到載體 PACYC184中，將該質粒導入感受態細胞大腸桿菌DE3中，由于大腸桿菌中本身含有內源性 的MEP途徑，故重組菌株pACYC184-M-crt (DE3)可以產生β-胡蘿卜素，但是含量比較低；
[0025] (4)重組菌株 pET32a(+)-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt (DE3)構建：
[0026] 將上游質粒pET32a(+)-dxs-idi_ispDF和下游質粒pACYC184-M_crt同時導入感 受態細胞中，篩選具有雙抗的陽性轉化子；
[0027] (5)重組菌株 pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt (DE3)構建：
[0028] 將上游質粒pTrcHis2B-dxs-idi_ispDF和下游質粒pACYC184-M_crt同時導入感 受態細胞中，篩選具有雙抗的陽性轉化子；
[0029] (6 )陽性轉化子發酵驗證
[0030] 重組菌株 pACYC184-M-crt (DE3)、pET32a(+)-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt (DE3)和 pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt(DE3)同時進行發酵，檢測其中 β -胡 蘿卜素產量。
[0031] 更優選的，所述的大腸桿菌基因工程菌，由包括以下步驟的方法制備而得：
[0032] (1)基因克隆
[0033] 以大腸桿菌K12MG1655基因組DNA為模板進行PCR擴增，得dxs基因，其中PCR所 用引物的序列分別如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，
[0034] 以大腸桿菌K12MG1655基因組DNA為模板進行PCR擴增，得idi基因，其中PCR所 用引物的序列分別如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示，
[0035] 以大腸桿菌K12MG1655基因組DNA為模板進行PCR擴增，得ispD基因和ispF基 因，其中PCR所用引物的序列分別如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示；
[0036] (2)表達載體構建
[0037] 將膠回收后的dxs基