一種制備巰基短肽金屬螯合物的方法
【專利說明】
一、技術領域
[0001]本發明屬于谷物蛋白利用技術領域，具體涉及以谷物蛋白水解液分離的巰基短肽制備金屬螯合物的方法。
二、【背景技術】
[0002]在我國，谷物加工過程中產生的副產品含有豐富的蛋白質。包括大米、小麥、玉米、大豆等谷物的加工副產物主要用作動物飼料，造成了蛋白質極大的浪費。谷物蛋白中不溶于水及中性鹽溶液，可溶于70?90%乙醇溶液的蛋白質被稱為醇溶蛋白。醇溶蛋白僅存在于谷物中，疏水性高，具有很強的耐熱性和耐脂性。在醫藥領域，常用作為控釋制劑、微球等新劑型的藥用輔料；在食品工業中，醇溶蛋白可以作為被膜劑，延長食品貨架期。但因其缺少賴氨酸、色氨酸等人體必需氨基酸，故而生物學價值低，應用范圍窄。因此有必要增強對醇溶蛋白的深加工和綜合利用的研宄與開發。
[0003]醇溶蛋白水解所得的巰基短肽含有大量游離巰基，可與有空軌道的金屬離子形成配位鍵，即形成螯合物。短肽微量元素螯合物具有生物化學穩定性好、易消化吸收、生物學價值高的優點。巰基作為自由基清除劑，清除自由基(.0H)的能力約為超氧化物歧化酶(SOD)的幾千倍，抗氧化活性極強。將巰基短肽類螯合物用做保健品，既補充了人體所需微量金屬元素，同時也補充了氨基酸營養。所以，利用谷物醇溶蛋白水解、分離獲得的巰基短肽與人體必需金屬元素螯合，制備出的巰基短肽-金屬螯合物有著重要的科學價值和廣闊的市場前景。
[0004]現有制備巰基短肽的方法，如申請號為201310216676.X、名稱為“一種小分子水解玉米短肽和高巰基肽的制備方法”的發明專利，該專利公開的方法是:用玉米蛋白粉為原料，制備出玉米蛋白粉膠體液，再經陰離子交換樹脂交換、酶水解反應，最終過濾、洗脫、濃縮和凍干，最終制得巰基短肽。該方法存在的主要問題是:1.在巰基交換時選用了陰離子交換樹脂，羧基等其他陰離子同巰基進行競爭交換，巰基吸附率低；2.陰離子交換樹脂在洗脫與活化過程中，所產生的酸堿廢液多；3.本方法只闡述了巰基短肽的制備方法，缺乏巰基短肽的應用研宄。
[0005]現有制備金屬螯合物的方法，如申請號為200610088997.6、名稱為“氨基酸短肽螯合物及其制備方法”的發明專利，該專利公開的方法是:以天冬氨酸短肽和谷氨酸短肽為原料，與金屬化合物螯合，經過濾、重結晶進行提純精制處理，最終制得氨基酸短肽螯合物。該方法存在的主要問題是:短肽螯合物中僅含天冬氨酸或谷氨酸，僅靠氨基酸的羰基氧原子螯合配位金屬離子，螯合作用力單一，全部解離的PH區間窄，瞬間即解離出高濃度的金屬離子，引發金屬中毒反應等安全問題；天冬氨酸和谷氨酸均為酸性氨基酸，可能形成偏離機體所需的低PH環境，既不利于代謝的正常進行，還可能導致局部酸中毒；此外，天冬氨酸和谷氨酸均為非必需氨基酸，不能為機體提供氨基酸營養。因此，該短肽-金屬螯合物的功能性差。三、
【發明內容】
[0006]本發明的目的是針對現有谷物蛋白粉利用率低的缺陷，提供一種制備巰基短肽金屬螯合物的方法。該方法具有充分利用資源，反應條件溫和、操作步驟簡單實用、產品應用廣泛、環保無污染等特點。
[0007]本發明的原理是:谷物蛋白粉中含有大量的醇溶蛋白，在酶的作用下可以水解成短肽。水解醇溶蛋白中的二硫鍵在弱酸性條件下還原生成游離巰基，該巰基與巰基樹脂可形成二硫鍵，從而與其它短肽分離。經過純化即獲得巰基短肽。巰基硫原子的孤對電子在適宜條件下與金屬離子的外層空軌道配位，形成巰基短肽金屬螯合物。
[0008]實現本發明的技術方案是:一種制備巰基短肽金屬螯合物的方法，該方法以谷物蛋白粉為原料，通過制備水解谷蛋白液、制備水解谷蛋白短肽溶液、制備ZnC12水溶液、制備巰基短肽金屬螯合物溶液、制備巰基短肽金屬螯合物凍干粉共5個步驟制備出巰基短肽金屬螯合物。所述方法具體步驟如下:
[0009]1.制備水解谷蛋白液
[0010]取麥蛋白粉或玉米蛋白粉或大米蛋白粉，用粉碎機粉碎后過60?120目的振動篩。分別收集過篩物和未過篩物，對收集的未過篩物，送入粉碎機中重新破碎；對收集的過篩物，按照過篩物質量(kg)與純凈水體積(L)之比為1: 10?20的比例，在攪拌下分散至純凈水中，再用稀NaOH溶液調節pH值至8.5?10.5 ;接著在攪拌下升溫至50?65°C，加入諾維信堿性蛋白酶Alcalase 3.0T進行一級酶水解1.5?2h，其中諾維信堿性蛋白酶Alcalase 3.0T與過篩物質量(kg)之比為1: 30?50。一級酶水解完成后，用稀HCl溶液調節PH值至5?6.5，維持溫度與一級酶水解反應溫度相同，加入木瓜蛋白酶進行二級酶水解1.5?2h，其中木瓜蛋白酶與過篩物質量(kg)之比為1: 30?50的比例。水解反應完成后放料入碟式分離機中，在6000?8000r/min的轉速下進行離心分離。分別收集離心清液和離心沉淀，對收集的離心沉淀，干燥后粉碎，用做飼料蛋白添加劑；對收集的離心清液，即為水解谷蛋白液，用于下一步制備水解谷蛋白短肽溶液。
[0011]2.制備水解谷蛋白短肽溶液
[0012]第⑴步完成后，先將第⑴步收集的水解谷蛋白液泵入截留分子量為1000?3000Da的納濾器中，在表壓為0.05?0.2MPa下進行第一次納濾，直至第一次納濾截留液體積降低至水解谷蛋白液體積的1/10?1/20時止。分別收集第一次納濾截留液和第一次納濾濾過液，對收集的第一次納濾截留液，含溶解性淀粉和蛋白質，與第(I)步收集的離心沉淀合并，干燥后用于飼料蛋白添加劑；對于收集的第一次納濾濾過液，再次泵入截留分子量為100?500Da的納濾器中，在表壓為0.05?0.2MPa下進行第二次納濾，直至第二次納濾截留液體積降低至第一次納濾濾過液體積的1/10?1/20時止。分別收集第二次納濾截留液和第二次納濾濾過液，對于收集的第二次納濾濾過液，含無機鹽離子和小分子肽，用于日用化妝品中的營養成分；對收集的第二次納濾截留液，即為水解谷蛋白短肽溶液。
[0013]3.制備 ZnCljK溶液
[0014]第(2)步完成后，按照鋅粉質量(kg)與體積濃度為2?10%的HCl溶液體積(L)之比為1: 10?20的比例，將鋅粉投入到體積濃度為2?10 %的HCl溶液中，攪拌下溶解I?3h，再真空過濾，收集濾液并用純凈水稀釋至Zn濃度為0.1?0.5mol/L時止，就制備出ZnCl2水溶液，用于下一步制備巰基短肽金屬螯合物溶液。
[0015]4.制備巰基短肽金屬螯合物溶液
[0016]第(2)步和第(3)步完成后，先將第(2)步制備的水解谷蛋白短肽溶液泵入裝有活化ZXC610硫脲樹脂或申請號為201510044783.8、名稱為“一種制備巰基修飾殼聚糖淺孔微球的方法”的發明專利所公開制備的淺孔微球狀巰基乙胺改性殼聚糖微球的層析柱中，進行交換分離。其中ZXC610硫脲樹脂和淺孔微球狀巰基乙胺改性殼聚糖微球統稱為巰基交換樹脂，巰基交換樹脂體積(L)與水解谷蛋白短肽溶液體積(L)之比為1: 20?40，水解谷蛋白短肽溶液的泵入流速為I?4倍層析柱體積(BV)/h。分別收集過柱液和交換有巰基短肽的層析柱，對收集的過柱液，進行減壓濃縮，用于制備發用植物水解蛋白濃縮液；對于收集的交換有巰基短肽的層析柱，先用I?2BV純凈水洗滌，分別收集洗滌液和經洗滌后的層析柱，對收集的純凈水洗滌液，與收集的過柱液合并后用于制備發用植物水解蛋白濃縮液；對于收集的經洗滌后的層析柱，用2?4BV、鋅濃度為0.1?0.5mol/L的ZnCl2水溶液、以I?4BV/h的流速進行洗脫，分別收集洗脫液和經該ZnCl2水溶液洗脫的層析柱，對收集的洗脫液，即為巰基短肽金屬螯合物溶液，用于下一步制備巰基短肽金屬螯合物凍干粉；對于收集的經該Z