一種高效生產l-瓜氨酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種高效生產L-瓜氨酸的方法，屬于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002] L-瓜氨酸是生物體內普遍存在的氨基酸之一，是一種非蛋白氨基酸L-瓜氨酸可 以通過抗羥基對DNA和酶進行保護，可以使DNA免受氧化反應的侵害。瓜氨酸的積聚可以 增強細胞的抗氧化作用，保護細胞不受到氧化作用的侵害。L-瓜氨酸在醫藥方面的應用主 要是作為異體排斥效應的指示劑。在疾病治療中，瓜氨酸的血管舒張作用也起到了很重要 的作用。在機體中瓜氨酸可以由精氨酸轉化而成，這個反應釋放內生NO,這種內生NO可保 持血壓正常。在風濕關節炎（RA)診斷治療中，瓜氨酸的作用也開始受到人們的關注。還有 研宄發現西瓜中瓜氨酸與"偉哥"（化學名稱為枸椽酸西地非那）具有相類似的藥理作用。
[0003] L-瓜氨酸作為一種重要的高值精細化學品，廣泛應用于食品、醫藥、化工和化妝品 等工業領域中。伴隨著對L-瓜氨酸研宄的不斷深入，使得L-瓜氨酸在很多方面有著廣泛 的應用前景，國內外需求巨大，擁有廣闊的市場前景。
[0004] 目前，瓜氨酸常用生產方法主要有化學合成法、提取法、發酵法、酶轉化法等。化學 合成法生產瓜氨酸是在堿性條件下水解精氨酸得到瓜氨酸。生產過程難以準確控制，產物 中含有D-瓜氨酸，影響質量，并且污染環境。由于天然產物中瓜氨酸含量較少，因此提取法 受原料來源限制，生產規模小，工藝較復雜，分離提純困難，產酸率低，成本高，經濟效益差， 因而一直沒有很好的發展。發酵法生產L-瓜氨酸，主要以傳統誘變選育為主，但是傳統的 誘變法來獲得L-瓜氨酸生產菌株隨機性較大，不易得到高產菌種，尤其是瓜氨酸高產菌株 篩選條件難以確定，同時發酵過程不易控制。而酶轉化法生產L-瓜氨酸有很多的優點，比 如：工藝簡單、成本低、產物純度非常高，最后的純化步驟也較其它制備方法少。
[0005] 已有報道米用 Baker' s yeast、Streptococcus faecalis、Micrococcus pyogenes、Clostridium perfringens、Bacillus pyocyaneus 等微生物生產的精氨酸脫亞 胺基酶（Arginine Deiminase，EC3. 5· 3· 6,簡稱ADI)，轉化L-精氨酸生產L-瓜氨酸。Ichiro Chibata等在 1973 年發現Leuconnostoc citrovorum ATCC 808KPseudomonas fluorescen IFO 3081、Pseudomonas ovalis IAM 1002 和 Psudomonas putida ATCC 4359 等菌株可以 產生ADI，以精氨酸為底物，L-瓜氨酸的終濃度可以達到80g/L。
[0006] 但是，目前經酶轉化法生產L-瓜氨酸，存在轉化率不夠高、產量不高、轉化時間長 以及生產強度小的問題。為了解決上述問題，本發明提供了一種高效生產L-瓜氨酸的方 法。
【發明內容】
[0007] 本發明提供了一種高產精氨酸脫亞胺酶工程菌及其構建方法，并利用該工程菌轉 化L-精氨酸生產L-瓜氨酸。本發明提供一種高生產強度，經濟，環保，低能耗的手段來生產 L-瓜氨酸的方法，該方法具有極高的生產強度，減少了工業生產的生產周期、極大提高了工 業化生產的生產效率。
[0008] 本發明的第一個目的是提供一種高效生產L-瓜氨酸的方法，是將來源于乳酸菌 的編碼精氨酸脫亞胺酶的基因在大腸桿菌中誘導表達，然后以菌體或破碎后的菌體為催化 劑，轉化L-精氨酸生產L-瓜氨酸。
[0009] 所述轉化的條件，在本發明的一種實施方式中，是：菌體或破碎后的菌體6_25g/ U底物精氨酸濃度為150-200g/L，轉化溫度為30-50°C，轉化時間4-12h。
[0010] 所述轉化，在本發明的一種實施方式中，溫度為45_50°C，轉化時間為4_8h。
[0011] 所述轉化，在本發明的一種實施方式中，pH為6. 5-7. 5。
[0012] 所述轉化，在本發明的一種實施方式中，優選pH7. 2、50°C、菌體15-25g/L。
[0013] 所述轉化，在本發明的一種實施方式中，是在搖床中進行，搖床轉速為 150-250rpm〇
[0014] 所述精氨酸脫亞胺酶，在本發明的一種實施方式中，其氨基酸序列是SEQ ID NO. 1 所示的序列。
[0015] 所述精氨酸脫亞胺酶，在本發明的一種實施方式中，其核苷酸序列是SEQ ID NO. 2 所示的序列。
[0016] 所述基因在大腸桿菌中誘導表達，在本發明的一種實施方式中，是將編碼SEQ ID NO. 1序列的基因克隆到pET28a，然后將重組質粒轉化到E. coliBL21 (DE3)中進行表達。
[0017] 所述轉化條件，在本發明的一種實施方式中，還包括添加終濃度為2% (v/v)的異 丙醇。
[0018] 所述誘導表達，在本發明的一種實施方式中，是菌株培養至0D_為0. 4-0. 6,加入 IPTG進行誘導，2-8h后收集菌體。
[0019] 所述誘導表達，在本發明的一種實施方式中，是菌株培養至0D_為0. 6,加入終濃 度為0. 4mmol/L的IPTG進行誘導，6h后收集菌體。
[0020] 所述方法，在本發明的一種實施方式中，具體是：（1)將編碼SEQ ID NO. 1序列的 基因克隆到pET28a，然后將重組質粒轉化到E. coli BL21 (DE3)中得到基因工程菌；（2)誘 導基因工程菌表達精氨酸脫亞胺酶，然后收集菌體；(3)將菌體洗滌后，加入菌體或破碎后 的菌體7-25g/L、精氨酸濃度為150-200g/L，在30-50°C下轉化時間4-12h。
[0021] 本發明的第二個目的是一種高效表達精氨酸脫亞胺酶的方法，是：以pET28a為載 體，E. coli BL21(DE3)為宿主，表達氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述的精氨酸脫亞胺酶。
[0022] 本發明還要求保護按上述方法得到的L-瓜氨酸，以及其在食品、化工、化妝品，以 及制備藥物方面的應用。
[0023] 在本發明中，菌體添加量按濕重計，是指菌懸液在8000rpm離心10min后去除上清 得到的菌體的重量。
[0024] 本發明的優點：
[0025] 1、本發明是使用來源于食品級微生物乳酸菌的精氨酸脫亞胺酶轉化L-精氨酸生 產L-瓜氨酸，該酶在大腸桿菌內表達后，仍表現出很高的活力，可以滿足工業化規模生產 的需求。
[0026] 2、發酵得到的菌體無需破碎，即可直接用于轉化，轉化使用的溫度范圍較寬，可以 在酶的最適溫度50°C進行，高溫下工程菌具有較高的透性，更有利于底物的吸收和產物的 釋放，反應速度得到極大的提高。在30-50°C，產量可達110-180g/L，整個轉化過程的平均 生產強度可達15. 0-37. 5g/L/h，僅需4-12h的轉化周期即可達到轉化終點。
【附圖說明】
[0027] 圖1 :底物濃度（A)和菌體濃度（B)對L-瓜氨酸產量的影響；
[0028] 圖2 :透性劑對瓜氨酸產量的影響；
[0029] 圖3 :水解生產L-瓜氨酸的過程曲線。
【具體實施方式】
[0030] ADI酶活力的測定：采用改進的阿氏法。酶活定義：在50°C和PH7. 2的條件下， Imin時間內產生Imol瓜氨酸的酶量為一個酶活單位。
[0031] L-瓜氨酸產量檢測
[0032] 取轉化液1000 Orpm離心2min，收集上清液，并以L-瓜氨酸作為標準品，配制標準 溶液。將適度稀釋后的上清液和標準溶液分別與2, 4-二硝基氟苯衍生，經0. 22 μ m微孔濾 膜過濾后，，用高效液相色譜法測定L-瓜氨酸的含量。標準曲線在200-800mg/L之間呈現 良好的線性關系，回歸方程：y = 〇. 5319x-103. 5203, R2= 0. 9990。
[0033] 高效液相色譜法測定L-瓜氨酸的含量
[0034] 色譜柱：C180DSHYPERSIL ;
[0035] 流動相：磷酸鹽緩沖液（pH7. 0)-乙腈-水（體積比為70:20:10)，用0. 22 μ m濾 膜過濾；
[0036] 柱溫：35°C ;
[0037] 檢測波長：360nm ;
[0038] 進樣量：10μ1;
[0039] 流速：lml/min。
[0040] 實施例1 :含精氨酸脫亞胺酶基因工程菌的構建
[0041] 按以下方法構建含精氨酸脫亞胺酶基因工程菌：
[0042] (1)通過分子生物學手段用序列分別如SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示的引物1 :
[0043] 5, -CATGCCATGGCAATGAACAATGGAATTAATGTTAACTCAG-3,和引物 2:
[0044] 5'-CCGCTCGAGTTACAAATCTTCACGGCAAAGTGG-3' 將來自于 Lactococcus Iactis 的 精氨酸脫亞胺酶基因（氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示） 進行PCR擴增：體系中加入LAtaq酶，94°C預變性3min，94°C變性30s，55°C退火30