一種利用木質纖維素原料生產檸檬酸的方法
【專利說明】
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物基化學品的生物制造和生物煉制領域，具體地說，是利用玉米秸桿等木質纖維素原料經過分步糖化與發酵或者同步糖化與發酵的方式生產檸檬酸。
【【背景技術】】
[0002]檸檬酸，又名枸櫞酸，是生命體主要代謝產物之一。廣泛用于食品、醫藥、化工等各個領域，是重要的有機酸之一。當前世界上90%以上的檸檬酸都是通過黑曲霉發酵生產的。我國檸檬酸生產的主要原料包括淀粉、葡萄糖、玉米粉、稻米粉、木薯粉等，現在工業化生產大都選用薯干、玉米粉為原料，而歐美等國家則采用葡萄糖，淀粉等精料進行發酵。在檸檬酸發酵過程中，黑曲霉需要大量的糖作為生長和發酵的碳源。所以，利用傳統的原料發酵檸檬酸，需要消耗大量的糧食。
[0003]秸桿等木質纖維素是最豐富的可再生碳水化合物資源，主要由纖維素、半纖維素和木質素構成，其中可發酵性的纖維素和半纖維素約占秸桿干重的一半以上。而且我國的秸桿資源豐富，秸桿年產量約為7億噸，但是由于缺乏合理的利用模式，這些秸桿通常被就地焚燒掉，從而造成了巨大的環境污染和交通安全。因此，利用儲量豐富、價格低廉的的秸桿發酵檸檬酸，可顯著降低檸檬酸生產成本，也減少了焚燒秸桿帶來的環境和交通安全問題。
[0004]上世紀70-80年代，我國篩選了利用淀粉、木薯、葡萄糖母液、蜜糖等原料的黑曲霉菌株，并且已經獲得比較可觀的發酵結果。上海工業微生物研究所從土壤中經酸性平板分離獲得的野生黑曲霉628作為出發菌株，經多次Co-Y射線和硫酸二乙脂等復合誘變，獲得了高產朽1檬酸菌株Co827(即黑曲霉Aspergillus niger M288)。該菌株可直接利用薯干粉發酵，產酸達12-13 %，平均轉化率為95 %，發酵周期54-64h，發酵指數1.8-2.0kg/(m3.h) ο朱亨政等利用Co-γ射線反復處理黑曲霉Co827，獲得變異株黑曲霉Co8-60-7。經過連續5批6m3發酵罐中間試驗，Co8-60-7平均產酸為19.05%，轉化率為95%，發酵周期117.8h，生產產酸穩定在18%以上，發酵周期79h，轉化率97.2%。
[0005]但是利用木質纖維素為原料的檸檬酸發酵還處于研究的初級階段。發酵結果與以淀粉、木薯為底物的結果大相徑庭。張建安等人(微生物學雜志，2001，21 (3)，5-8)以麥草纖維素酶解液為原料,利用黑曲霉(Aspergillus niger Van Tieghem)發酵朽1檬酸，發酵周期為10411，獲得檸檬酸10.528/1，糖轉化率為60.80%。Gurpreet Singh Dhillon等(B1chemical Engineering Journal54(2011)83-92)利用黑曲霉(Aspergillusniger NRRL567)在蘋果渣超濾沉淀物_1 (APS-1、懸浮顆粒45±5g/l)、蘋果渣超濾沉淀物-2(APS-2、懸浮顆粒80g/l)、乳清(LS)、市政污泥(MSS)、淀粉工業水(SIW)中，篩選了最適合用于深層發酵的底物為APS-1,經3%乙醇誘導后，獲得朽1檬酸產量為18.2±0.4g/L。由于檸檬酸產量較低，所以，該工藝不具備產業化的前提。
[0006]因此，選擇合適的木質纖維素原料為檸檬酸發酵的底物，獲得高產量和高得率的檸檬酸是利用木質纖維素發酵檸檬酸工藝產業化的關鍵因素。本發明以秸桿等木質纖維素為原料，液體培養黑曲霉Aspergillus niger M288,接種于含有較高糖濃度的木質纖維素酶解液中發酵生產朽1檬酸或者接種于含有一定固體含量的木質纖維素的反應器中，并加入纖維素酶進行同步糖化與發酵生產檸檬酸。
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【發明內容】
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[0007]本發明目的在于拓展工業用檸檬酸發酵的發酵基質，使用價格低廉、資源豐富的木質纖維素，提供一種利用木質纖維素水解液發酵生產檸檬酸的方法。
[0008]本發明的構思:以木質纖維素為原料低成本高效生產檸檬酸；使用黑曲霉Aspergillus niger M288作為發酵菌種，黑曲霉Aspergillus niger M288購自上海市工業微生物研究所菌種保藏中心；需要高濃度糖作為發酵的碳源；以農業殘留玉米秸桿為原料，經預處理、脫毒后作為培養基；液體培養獲得作為種子的細胞，接種于木質纖維素酶解液或同步糖化與發酵體系中，黑曲霉Aspergillus niger M288把纖維素降解得到的葡萄糖轉化為檸檬酸。
[0009]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:
[0010](I)極低水用量的木質纖維素原料高溫稀酸預處理:
[0011]取干基玉米秸桿，按2: I的固液比(w/w)加入質量濃度為5% (w/w)的稀硫酸，攪拌均勻后，將玉米秸桿裝填入預處理反應器中進行預處理，溫度為190°C、1.2MPa，維持3分鐘；預處理結束后，取出物料并冷卻至室溫，盛入塑料袋中備用；
[0012]預處理方法包括但不限于稀酸預處理，蒸汽爆破，氨纖維爆破、液氨膨爆、亞硫酸鹽預處理、堿法預處理、機械磨碎預處理、生物預處理等,優選稀酸預處理方法；木質纖維素原料經過了預處理，使木質纖維素的結構得到改變，提高其可酶解性。
[0013]所述的木質纖維素原料包括玉米秸桿、麥秸、稻草、棉桿、玉米芯及其殘渣、木屑、能源植物或者林業廢棄物、廢紙，紙板，建筑和拆遷木材廢料和庭院廢物等。
[0014](2)預處理后木質纖維素原料的脫毒處理
[0015]固態生物脫毒的具體過程為:將靜置培養3天的脫毒菌種Amorphotheca resinaeZNl，其保藏編號CGMCC7452，斜面接入盛有200g稀酸預處理后且pH調整至6.0的玉米秸桿的生物脫毒反應器中，維持25°C、60%的濕度進行脫毒共培養3天；將上述脫毒共培養的200g秸桿接入盛有2000g稀酸預處理后且pH調整至4.8-5.5的玉米秸桿的生物脫毒反應器中，維持25°C、60%的濕度進行脫毒共培養10-12天；脫毒后將物料保存于-20°C冰箱中待用；
[0016]脫毒處理方法包括但不限于生物脫毒、水洗、過堿化處理(Overliming)、離子吸附、減壓蒸餾、活性炭脫色等，優選生物脫毒；經脫毒脫除的抑制物包括甲酸、乙酸等有機酸類化合物，糠醛、羥甲基糠醛等呋喃類化合物，香蘭素、對羥基苯甲醛等酚類化合物等。
[0017](3)利用液體培養基培養黑曲霉Aspergillus niger M288
[0018]黑曲霉Asperillus niger M288 種子在 20_50°C, 50-800rpm 的條件下培養。種子培養基的成分為葡萄糖50-100g/L，氯化銨1.0-4.0g/L，磷酸二氫鉀1.0-4.0g/L，七水合硫酸鎂0.1-0.5g/L，五水合硫酸銅0.1-0.5mg/L,七水合硫酸鋅0.1-5.0mg/L,七水合硫酸亞鐵 1.0-10.0mg/L,氯化錳 1.0-5.0mg/L ；
[0019]所述朽1檬酸的生產菌株為黑曲霉Aspergillus niger M288,黑曲霉Aspergillusniger M288購自上海市工業微生物研究所菌種保藏中心；但本發明所涉及的菌種不限于所提供的菌種，還包括能夠發酵生產朽1檬酸的其他菌種，如黑曲霉Asperillus Niger M203、黑曲霉Aspergillus niger M228等，以及通過誘變、基因工程等操作改造的上述菌株或其他菌株。
[0020](4)檸檬酸的生產
[0021]利用分別糖化與發酵檸檬酸的方式，糖化液的制備條件為:固體含量為10-40%，酶量為5-30FPU/g DM，溫度為45-55°C，pH為4.5-5.5，糖化36-60小時，然后進行離心或壓濾等方法獲得水解液；利用糖化液進行檸檬酸生產的條件為:初始pH為2.0-6.0，菌種轉接量為5-20% (體積百分比)，在25-40°C，50-800rpm發酵100-216小時，生產檸檬酸。檸檬酸生產中的營養物為:氯化銨0.5-4.0g/L，磷酸二氫鉀1.0-4.0g/L，七水合硫酸鎂0-0.5g/I,五水合硫酸銅0-0.5mg/L,七水合硫酸鋅0-2.5mg/L,七水合硫酸亞鐵0-10.0mg/L,氯化猛 0-5.0mg/L ο
[0022]或者利用木質纖維素同步糖化發酵檸檬酸，其條件為:初始pH為2.0-6.0,菌種轉接量為5-20% (體積百分比)，固體含量為10-40%，酶量為5-30FPU/gDM，通氣量為
0.Ι-lOvvm，在30-50°C，50-800rpm發酵100-216小時，生產檸檬酸。同步糖化與發酵中所需的營養物為:氯化銨0.5-4.0g/L,磷酸二氫鉀1.0-4.0g/L,七水合硫酸鎂0-0.5g/L，五水合硫酸銅0-0.5mg/L,七水合硫酸鋅0-2.5mg/L,七水合硫酸亞鐵0-10.0mg/L,氯化猛0-5.0mg/Lο
[0023](5)檸檬酸產品的分離提取
[0024]包括固液分離、沉淀提純、硫酸溶解、離子交換、濃縮結晶步驟，即可得到結晶狀的檸檬酸。
[0025]與現有技術相比，本發明的積極效果是:
[0026](I)本發明以木質纖維素為原料發酵生產檸檬酸，基質成本低廉，來源廣泛，充分利用了可再生資源，“不與人類爭糧，不與糧爭地”，能夠滿足檸檬酸不斷擴大的市場需求；
[0027](2)本發明在發酵過程幾乎不需添加額外的碳源，成本低，檸檬酸濃度和產率高，便于后續分離和純化；
【【附圖說明】】
[0028]圖1實施例1發酵過程曲線；
[0029]圖2實施例2發酵過程曲線。
【【具體實施方式】】
[0030]以下提供