一種全細胞催化合成香草醛的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及香料領域，尤其涉及一種全細胞催化合成香草醛的方法。
【背景技術】
[0002] 香草醛（4-羥基3-甲氧基-苯甲醛)，俗稱香蘭素、香草素、香蘭醛、香茅醛，是全 球最重要的香味物質之一，具有濃郁的香子蘭花的氣味，素有"香料皇后"的美譽。其以游 離態和葡萄糖苷的形式廣泛存在于自然植物中，如香莢蘭豆、丁香油、天門冬、甜菜根、安息 香、蘇合香膏，較集中存在于香莢蘭的豆莢中(含量1. 5%_3%)。由于其特殊的香味及結構特 征，被廣泛應用于各個領域，其中約60%用作食品、糖果、飲料中的香味物質，約33%用作香 料和化妝品中的成分，約7%作為藥物中間體。
[0003] 香草醛每年的需求量在10, 000 t以上。目前市場上的香草醛絕大部分來自化學 合成，主要以愈創木酚和木質素為合成原料，價格較低，每公斤約13美元。由香莢蘭中提取 的天然香草醛年產量僅20 t，約占0. 2%的份額，價格昂貴，每公斤達4, 000美元。而用微生 物轉化法生產的香草醛與植物提取的天然香草醛等同，被稱為生物香草醛，符合EU和FDA 對天然香精的食用安全要求，但目前其年產量只有數噸，每公斤價格600~1000美元。
[0004] 隨著人們對健康安全的愈發重視，天然香草醛的需求不斷上升。微生物轉化法生 產香草醛在生產周期上和規模擴大方面要優于植物提取法，生產成本低于植物提取法，而 產品品質優于化學合成的香草醛，且無污染、對環境友好，是一種極有前景的制備方法，因 此越來越受到青睞。
[0005] 但是現有技術中，微生物轉化法制備香草醛仍然存在許多不足： 1. 容易生成副產物，產率低。因為微生物本身是一個多酶體系，把它直接加入到反應 中，微生物里的某些酶可能與目的酶競爭相同的底物，導致底物利用率下降、副產物的生 成、產率低。再者，香草醛生成后也會被微生物中的酶進一步代謝為香草酸或其他代謝產 物； 2. 底物在水溶液中的溶解度很低，并且底物會對微生物的生長或酶的活性有抑制作 用； 3. 產物香草醛及其他副產物也會對微生物的生長或酶的活性有抑制作用。
[0006] 因此，現有技術還有待于改進和發展。
【發明內容】
[0007] 鑒于上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種全細胞催化合成香草醛的 方法，旨在解決現有技術中香草醛微生物轉化合成產量低、容易生成副產物等問題。
[0008] 本發明的技術方案如下： 一種全細胞催化合成香草醛的方法，其中，包括步驟： S1、將保存的菌株CGMCC1347接入種子培養基中活化，32~40°C、100~300rpm振蕩反應 6~36h得到種子液； 52、 反應結束后，取2ml種子液接入30~70ml發酵培養基中，32~40°C、100~300rpm振蕩 反應12~36h得到菌液； 53、 取IOml菌液3000~6000rpm離心5~20min，棄上清，獲得濕菌體； 54、 往濕菌體中加入5~15ml緩沖溶液，重懸菌體并轉移至裝有0. 1~0. 5g異丁香酷的錐 形瓶中，蓋上橡膠塞，25~35°C、100~300rpm振蕩反應48~96h ; 55、 反應結束后，加入5~15ml95%乙醇以終止反應，沉淀蛋白并溶解底物和產物，充分 混勾后 5000~8000rpm 離心 IOmin ; 56、 取離心后的上清液，用乙醇稀釋，過濾后得到香草醛。
[0009] 所述的全細胞催化合成香草醛的方法，其中，所述步驟S4中，錐形瓶中還添加有 50~15〇μ1離子溶劑。
[0010] 所述的全細胞催化合成香草醛的方法，其中，所述離子溶劑為離子液體或深度低 共熔溶劑。
[0011] 所述的全細胞催化合成香草醛的方法，其中，所述離子液體為咪唑型離子液體、銨 鹽離子液體或磷鹽離子液體。
[0012] 所述的全細胞催化合成香草醛的方法，其中，所述咪唑型離子液體為[麗Im] [MeSO 4]、[EMIm] [MeSO4]、[BMIm] [MeSO4]、[Me (OEt) 3MIm] [Tf2N];所述銨鹽離子液體為 [Choline] [Cl]、[Choline] [H2PO4]、[NMe3] [MeSO3]、[NBu4] [MeSO3]、[NMe3] [H2PO4]、[ETM] [Tf2N];所述磷鹽離子液體為[PBu 4] [Ac]。
[0013] 所述的全細胞催化合成香草醛的方法，其中，所述深度低共熔溶劑為膽堿醋酸鹽 型DESs或膽堿氯鹽型DESs。
[0014] 所述的全細胞催化合成香草醛的方法，其中，所述膽堿醋酸鹽型DESs為ChAc/U、 ChAc/A、ChAc/G 或 ChAc/EG〇
[0015] 所述的全細胞催化合成香草醛的方法，其中，所述膽堿氯鹽型DESs為ChCl/U、 ChCl/A、ChCl/G 或 ChCl/EG〇
[0016] 所述的全細胞催化合成香草醛的方法，其中，所述步驟S4中，錐形瓶中還添加有 無機氮源。
[0017] 所述的全細胞催化合成香草醛的方法，其中，所述無機氮源為尿素。
[0018] 有益效果：本發明的反應體系中，通過添加離子溶劑或無機氮源，使得香草醛的產 率得到大幅提升，同時通過選用高特異性的菌株CGMCC1347,其高特異性地轉化異丁香酚生 成香草醛，減少了副產物的生成，降低了后期分離純化的成本。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發明中添加不同咪唑型離子液體對香草醛產率的影響對比圖。
[0020] 圖2為本發明中添加不同銨鹽離子液體對香草醛產率的影響對比圖。
[0021] 圖3為本發明中添加磷鹽離子液體對香草醛產率的影響對比圖。
[0022] 圖4為本發明中添加不同膽堿醋酸鹽型深度低共熔溶劑對香草醛產率的影響對 比圖。
[0023] 圖5為本發明中添加不同膽堿氯鹽型深度低共熔溶劑對香草醛產率的影響對比 圖。
[0024] 圖6為本發明中添加不同含量尿素對香草醛產率的影響對比圖。
[0025] 圖7為本發明中實施例4上清液的高效液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0026] 本發明提供一種全細胞催化合成香草醛的方法，為使本發明的目的、技術方案及 效果更加清楚、明確，以下對本發明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例 僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0027] 本發明選取了一株高特異性的菌株，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中 心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研宄所，保藏編號是： CGMCC1347,此菌株已于2005年4月8日保存于中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生 物保藏中心，此菌株屬于紡錘芽孢桿菌Bacillus fusiformis，該菌株能夠高特異性地轉化 異丁香酚生成香草醛，無副產物生成。
[0028] 本發明所提供的全細胞催化合成香草醛的方法，其包括步驟： 51、 將保存的菌株CGMCC1347接入種子培養基中活化，32~40°C、100~300rpm振蕩反應 6~36h得到種子液； 52、 反應結束后，取2ml種子液接入30~70ml發酵培養基中，32~40°C、100~300rpm振蕩 反應12~36h得到菌液； 53、 取IOml菌液3000~6000rpm離心5~20min，棄上清，獲得濕菌體； 54、 往濕菌體中加入5~15ml緩沖溶液，重懸菌體并轉移至裝有0. 1~0. 5g異丁香酷的錐 形瓶中，蓋上橡膠塞，25~35°C、100~300rpm振蕩反應48~96h ; 55、 反應結束后，加入5~15ml95%乙醇以終止反應，沉淀蛋白并溶解底物和產物，充分 混勾后 5000~8000rpm 離心 IOmin ; 56、 取離心后的上清液，用乙醇稀釋，過濾后得到香草醛。
[0029] 所述步驟S4中，錐形瓶中還添加有50~15〇μ1離子溶劑，本發明中所采用的離子溶 劑分為離子液體（ILs)和深度低共熔溶劑（DESs)兩大類。
[0030] 其中的離子液體（ILs)是由特定的有機陽離子和無機或有機陰離子構成的在室 溫或近室溫下呈液態的熔鹽體系，具有蒸汽壓低、熔點低、不易揮發、溶解性能優良、可設計 性高等優點，在生物催化領域具有很高的應用價值。
[0031] 其中的深度低共熔溶劑（DESs)是由季銨鹽和氫鍵供體按照一定的摩爾比混合而 成的低熔點混合物，是一種新型的離子溶劑，與傳統的離子液體性質相近，而且具有原料成 本更低、制備更簡單、生物相容性更高、溶劑設計選擇范圍更廣等優點。酶在含有DES的體 系中催化轉酯化、脫氨基等反應時，其催化活性和穩定性要比在傳統的有機溶劑中高。
[0032] 具體來說，本發明所涉及的離子液體（ILs)有3型共35種（咪唑型離子液體17 種、銨鹽離子液體17種、磷鹽離子液體1種），深度低共熔溶劑（DESs)有2型共24種（膽 堿醋酸鹽深度低共熔溶劑12種、膽堿氯鹽深度低共熔溶劑12種）。通過添加一定量不同的 離子溶劑，篩選出多種離子溶劑，它們的少量添加即可提高香草醛的產率。本發明還可通過 添加結構簡單的無機氮源，例如尿素，來提高香草醛的產率。
[0033] 實施例1 a、將保存的菌株CGMCC1347接入種子培養基中活化，37°C、220rpm振蕩反應12h得到種 子液，種子培養基（IL)的配方是：蛋白胨l〇g、酵母膏5g、NaCl 10g，調整pH至7.0; b、 反應結束后，取2ml種子液接入50ml發酵培養基中，37°C、220rpm振蕩反應16h得到 菌液，發酵培養基（IL):蛋白胨 5g、KH2P04 5.2g、K2HP04.3H20 14g、MgS04.7H20 Ig (ρΗ7·0); c、 取IOml菌液5000rpm離心10min，棄上清，獲得濕菌體； d、 往濕菌體中加入IOml緩沖溶液，重懸菌體并轉移至裝有0. 246g異丁香酷和IOOul 離子液體的錐形瓶中，蓋上橡膠塞，30°C、200rpm振蕩反應72h ;其中的緩沖溶液為磷酸緩 沖溶液（IL) AH2PO4 5. 2g、K2HPO4 · 3H20 14g ;pH7. 0 (下同）； e、 反應結束后，加入IOml 95% (質量分數，下同）乙醇以終止反應，沉淀蛋白并溶解底 物和產物，充分混勻后7000rpm離心10min ; f、 取離心后的上清液，用95%乙醇稀釋10倍，過濾后進行HPLC檢測。
[0034] HPLC檢測采用甲醇和0. 01%乙酸水溶液混合梯度洗脫（0-5min，20%-60% ; 5-15min，60% ; 15-20min，60%-20%)，流速 lml/min，進樣量 IOul，波長 270nm。
[0035] 如圖1所示，CONTROL