一種茵達霉素及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物制備技術領域，尤其涉及一種由鏈霉菌發酵產生的茵達霉素的 制備方法及其用途。
【背景技術】
[0002] 刺吸式口器害蟲，例如蚜蟲、葉螨、飛虱等。它們親緣中的分類地位差別很大，但危 害方式十分相似。它們以細長針管狀口器刺吸植物體表（包括葉、花、果、皮）中的營養汁 液，使細胞受到破壞，生長失去平衡，嚴重時植株停止生長，甚至全株萎蔫枯死。刺吸式口器 害蟲大多體型較小，但繁殖速度快，數量極多，群體危害期長，全年發生世代多。同時還是是 病毒的攜帶者和中間傳媒，可以導致作物感染病毒病，嚴重影響農業生產。
[0003] 實踐中，多使用化學藥劑防治刺吸式口器害蟲，比如吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲嗪等，有 的易于產生抗性，有的農藥殘留時間長。農業生產中急需一種環境友好的防治刺吸式口器 害蟲的生物類藥劑。
【發明內容】
[0004] 為了解決以上問題，本發明提供了一種制備簡單、效率高，療效好，可對不同種蚜 蟲具有良好的防治效果的茵達霉素及其制備方法及其用途。
[0005] 上述的茵達霉素，為鏈霉菌P56發酵產生的次生代謝產物，所述茵達霉素的菌種 保藏號為 CGMCC No. 9268。
[0006] -種茵達霉素的制備方法，其包括以下步驟：
[0007] (1)制備無菌空氣，即將空氣通過無菌過濾器壓縮機后，濾出雜質和灰塵，得到潔 凈空氣；再將從壓縮機壓出來溫度為25°C~30°C，壓力為0. 25±0. 02Mpa的熱空氣進行二 次過濾，通過過濾部件，最后到達發酵罐；
[0008] (2)處理設備表面，即對發酵罐進行消毒處理，用質量分數為1 %的氯胺溶液處理 發酵罐5~6h，再處理結束的氯胺倒入化學專用水渠內，用水沖洗發酵罐，在接種之前再 用氯胺擦拭發酵罐的表面；
[0009] (3)制備三角瓶中種子材料
[0010] (3. 1)制備瓶裝培養基，即選用適量的葡萄糖、大豆粉、氯化鈉、硫酸銨、碳酸鈣和 自然PH的水制備培養基；
[0011] (3. 2)滅菌三角瓶培養基，即將上述步驟（3. 1)制備的培養基放入三角瓶內，在溫 度為120°C~130°C下滅菌40min，pH值為7. 1~7. 2 ;
[0012] (3. 3)菌種培養，即在無菌條件下把長有孢子的菌種接種到上述步驟（3. 2)含有 培養基的三角瓶中，再在轉速為180~220rpm/min下培養36~48h，以得到優質種子液；
[0013] (4. 0)菌種培養
[0014] (4. 1)準備并檢查種子罐，即選用大體積的種子罐，配置鼓泡攪拌器，提供消泡劑 材料的驅動壓縮機，通過進料口放入培養基，冷卻發酵罐夾套體；接著，將種子罐內設置清 潔水過濾器和空氣過濾器，放空種子罐利用I %的氯胺溶液處理5h~6h ;再用稀釋三倍的 氯胺徹底清洗種子罐；然后將發酵罐加壓達到〇. IMpa觀察發酵罐是否泄漏，同時用肥皂水 檢查所有閥門；
[0015] (4. 2)滅菌種子罐和過濾器，即將上述步驟（4. 1)檢查后的種子罐以及過濾器在 溫度為126°C~128°C下，高壓滅菌40min~60min ;
[0016] (4. 3)制備培養基并滅菌，即在上述步驟（4. 2)滅菌后的種子罐中加入溫度為 40°C~50°C的水，然后在攪拌器工作下加入大豆粉和葡萄糖，并在80°C條件攪拌lOmin，然 后加入氯化鈉、硫酸銨和碳酸鈣，持續攪拌30min制備培養基；
[0017] (4. 4)茵達種子液轉接，即將上述步驟（4. 3)三角瓶內發酵的培養物轉接到種子 培養基內，按體積比5 %~10 %的接種量接種，再通過空消的裝配機加入接種物質；
[0018] (4.5)轉入接種物質，即將上述步驟（4.4)中培養液在轉接過程中溫度為 28±1°C，設備壓力為0· 02Mpa~0· 05Mpa，攪拌器轉速在Oh~24h為200rmp/min、24h~ 48h為250rmp/min、48h~96h為300rmp/min，空氣輸入量為7m 3/min，加入消泡劑，制備發 酵用種子物質；
[0019] (5)茵達發酵
[0020] (5. 1)準備及檢測發酵罐，即降低壓力后放空發酵罐，用水徹底清洗，檢測鼓泡口 是否干凈，通過水層進入Imin~2min的空氣，接著檢測空氣通路閥門的氣密性，檢測進氣 口和過濾器是否漏氣，檢查結束后，對發酵罐和過濾器進行滅菌；
[0021] (5. 2)發酵罐與過濾器的空消，即將密封的發酵罐和過濾器在126°C~130°C條件 下空消lh，發酵罐空消后降低壓力，準備放入培養基；
[0022] (5. 3)配制滅菌培養基，即將由葡萄糖、大豆粉、氯化鈉、硫酸銨、碳酸鈣和水配制 好的培養基加入裝有增加溶氧的發酵罐中，通入蒸汽〇. IMPa下滅菌30min ;
[0023] (5. 4)發酵罐內茵達合成，即按5%~10%接種量，將種子罐的發酵液轉接到發酵 罐中，在發酵溫度為27°C~29°C，壓力為0· 015Mpa~0· 02Mpa，輸入空氣量為0· lL/min~ 0. 3L/min，空氣溫度為25°C~30°C，發酵96h，以合成茵達霉素；
[0024] (6)從原始發酵液中分離菌絲體，即取出上述步驟（5. 4)發酵罐中發酵液，利用離 心機離心，在室溫下且轉速為5000rpm離心10min~15min，將提取含有雜質的菌絲體移至 燒杯內，其余液體倒入另一燒杯內；
[0025] (7)從菌絲體中分離茵達，即將上述步驟（6)中的菌絲體放入甲醇或乙醇，在 500rpm下攪拌15min提取茵達，提取結束后得到穩定的乳化液；
[0026] (8)從菌絲體中分離提取物，即利用離心機在轉速為5000rpm，溫度為20°C，時間 為20min分離菌絲體的有機相即甲醇、乙醇和茵達，將回收的有機相加入旋轉蒸發儀的燒 瓶內，分離得到的菌絲體放入另一裝置內；
[0027] (9)提取物濃縮，即在溫度為50°C，絕對對壓力為0· 05Mpa~0· 07Mpa條件下，利 用旋轉蒸發儀對提取物進行濃縮處理，蒸發開始前加入體積5%的蒸餾水，直到有機物完全 蒸發為止，離心后將水溶性的提取物放進烘干裝置內，蒸發后的甲醇可以循環利用；
[0028] (10)烘干樣品，即利用烘干箱，在溫度為80°C，負壓0. 05Mpa~0. 07Mpa條件下將 上述步驟（9)收集樣品中的水分烘干，烘干后得到膏狀有特殊氣味物質，在膏狀物中添加 2%~5%的壬基酚聚氧乙烯醚和30%~40%的抗生素制劑。
[0029] 所述茵達霉素的制備方法，其中：將所述步驟（5. 4)制備的發酵液，添加助劑后直 接噴霧干燥，得到含有抗生素和活孢子的原粉，再添加適當的潤濕劑和分散劑制成可濕性 粉劑，可直接應用于農業生產，原粉中活孢子的數量可以達到LOXlO 8~1.0X1011。
[0030] 所述茵達霉素的制備方法，其中，所述步驟（3. 1)、步驟（4.3)和步驟（5.3)中的 培養基中均是葡萄糖〇. 8 %~1. 2 %、大豆粉0. 8 %~1. 2 %、氯化鈉0. 4 %~0. 6 %、硫酸銨 0· 4%~0· 6%、碳酸鈣 0· 2%~0· 4%。
[0031] 所述茵達霉素的制備方法，其中，所述步驟（3. 3)三角瓶內發酵的培養物是通過 三角瓶鏡檢檢測和生物指標檢測得出優質種子液；所述優質種子液指標為：培養物生長 形態狀況、原生質體分布均勻、顯微鏡下觀察菌絲體網狀、排列緊密、填充整個視野、PH值 7. 0~7. 2之間、菌絲體有淺綠色-棕色、無雜菌，不符合以上一種或幾種指標的種子液倒入 廢水處理裝置中；所述優質種子液接種時，按5%~10%接種量進行，種子液在4°C~5°C條 件下最多存放10天。
[0032] 所述茵達霉素的制備方法，其中：所述步驟（5. 1)在檢測進氣口和過濾器是否漏 氣時，設備的壓力為〇. 〇5Mpa~0. 08Mpa，通氣30min，此時使鏈接處的閥門電氣化，設備內 的壓力不能超過〇.〇〇5Mpa;所述步驟（5.1)中的發酵罐是帶有圓形蓋的圓柱型容器，并安 裝有通風攪拌裝置，以提高溶氧，另外還裝有消泡器、取樣口、視鏡、冷卻水夾套、溫度計和 壓力表；所述步驟（5. 3)的發酵罐在其內部空氣壓力降低到0. 04Mpa~0. 06Mpa時，打開 出氣口閥門，空氣排出，以壓力為標準檢查所有密封口，同時把整個發酵罐用肥皂水洗滌， 檢查結束以后對密封裝置預熱；空氣進去到整個發酵罐內，通過所述消泡器、溫度計和取樣 口，此時設備內壓力降到0. 15Mpa~0. 18Mpa，而提供熱空氣的溫度到達126°C~130°C滅 菌Ih~I. 5h ;滅菌結束后，緩慢降低壓力到0. 02Mpa，空氣進入所述消泡器內，溫度降至 27°C~30°C，設備內壓強維持在0. 02Mpa~0. 025Mpa，此過程不能突然降低壓力，以避免倒 吸入外面空氣；在發酵溫度為30°C~31°C時取樣測pH值，鏡檢觀察菌體生長情況，測定生 理指標。
[0033] 所述茵達霉素的制備方法，其中：所述步驟（5.4)在整個發酵過程中開口組件、 取樣器、空氣進樣口處于高溫蒸汽保護下完成，發酵結束由消耗營養物質所占比例OPB = 〇 : 1、氨氮質量分數1%和菌絲體生長形態學狀態作為評判標準。
[0034] 所述茵達霉素的制備方法，其中：所述步驟（6)的離心管在離心過程中，其內部上 層為原始相，下層為菌絲體；所述步驟（7)中最終菌絲體與甲醇的重量比為1 : 5。
[0035] -種茵達霉素的用途，其中對吸式口器害蟲有明顯的防治作用。
[0036] 所述茵達霉素的用途，其中可用于防治豌豆蚜、棉蚜和桃蚜，還可用于防治薊馬、 飛虱和葉螨。
[0037] 有益效果：