一種shRNA-Ago2共表達慢病毒RNAi載體、重組質粒及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于功能基因組學研究領域，涉及一種慢病毒RNAi載體、重組質粒及其構 建方法。
【背景技術】
[0002] RNA干擾（RNA interference, RNAi)是一種在進化過程中高度保守的，由雙鏈 RNA(double-stranded RNA,dsRNA)誘發同源mRNA高效特異性降解的基因轉錄后沉默現象 (Fire A. , Nature, 1998. 391 (6669) :p. 806-11.)。RNAi 技術不僅揭示了細胞內基因沉默機 制，是繼酵母雜交系、DNA芯片、基因敲除、反義RNA等技術后的又一解讀基因功能的有效研 究手段，極大地促進了人類揭示生命奧秘的進程。RNA干擾在細胞中的作用機制分為三個 階段：第一個是起始階段，外源性或內源性雙鏈RNA分子被細胞內的Dicer酶加工剪切成 21-25個核苷酸長度的小分子雙鏈（small-interfering RNAs，siRNA);第二個是RISC的組 裝階段，產生的siRNA中其中一條鏈與Argonaute (Ago)及其相關蛋白組裝形成具有活性 的沉默復合體RISC (RNA-induced silencing complex);第三個是效應階段，組裝形成的 具有活性的RISC作用于與其上的單鏈小分子RNA序列互補的mRNA，通過將該mRNA降解使 其翻譯受到抑制，最終導致基因的沉默（Siomi，H. and M. C. Siomi，Nature, 2009. 457 (7228) :ρ·396-404)。
[0003] 但是，在RNAi的實際應用中經常發現，即使是合理設計的shRNA仍不能發揮有效 的干擾作用。經過分析，歸納出了影響shRNA干擾效果的幾種因素：如驅動siRNA表達的啟 動子、siRNA作用位點、多個siRNA的串聯表達、siRNA與RISC的結合情況和干擾載體的轉 染效率等（Dykxhoorn, D. M. and J. Lieberman, Annu Rev Biomed Eng, 2006. 8: P. 377-402)。
[0004] 針對上述問題，研究人員致力于發現增強ShRNA干擾效率的RNAi相關蛋白因子。 Ago2是Argonaute蛋白家族中唯一包含有切割活性的蛋白質。細胞內RNAi離不開Ago2的 參與（Juvvuna P.K·· Nucleic Acids Res, 2012. 40(14) :ρ· 6808-20)，Ago2 不僅可與 siRNA 結合，還可通過與miRNA結合從而提高成熟miRNA在細胞中的水平和穩定性（Ghildiyal M.and P.D. Zamore. Nat Rev Genet, 2009. 10(2): P. 94-108)。細胞內的 siRNA 和 miRNA 則 競爭性地與數量有限Ago2結合，外源導入siRNA可能會導致如下情況：一方面，細胞內大 多數Ag〇2可能被miRNA占據，外源導入的shRNA則可能由于沒有足夠的Ag 〇2來對其進行 裝載，從而導致部分shRNA未能發揮作用就被降解；另一方面，研究表明siRNA、shRNA比 pre-miRNA在結合RISC方面存在優勢，說明進入細胞的外源shRNA可能比miRNA優先占用 細胞內 RISC 即消耗Ago2 (Castanotto D. Nucleic Acids Res, 2007. 35(15) :ρ· 5154-64)，那 么內源性miRNA可能由于沒有足夠的Ago2對其進行裝載而被降解，導致依賴miRNA途徑的 細胞活動受到影響。因此，細胞內Ago2的可用數量不足，不僅會影響shRNA干擾作用的發 揮，也可能影響細胞內miRNA正常功能的運作。在維持細胞miRNA正常功能的前提下，細胞 內RNAi的效率很大程度上取決于可用Ag 〇2的數量。已經有研究證明，過表達Ag〇2蛋白可 以提高哺乳動物細胞內的RNAi效率。
[0005] Diederichs等通過將Ago2與shRNA共轉染于HEK293細胞，檢測細胞中的熒光 表達量發現Ago2能明顯提高RNAi沉默效率（Diederichs S. Proc Natl Acad Sci U S A，2008. 105(27) :ρ· 9284-9)。Grimm等在小鼠中共同表達shRNA與Ago2,發現Ago2能明顯 增強沉默效率并延長沉默時間，同時能降低shRNA給小鼠肝臟帶來的毒性（Grimm，D. J Clin Invest, 2010. 120(9) :p. 3106-19)。但是，采用Ago2與shRNA共轉染的方式導入到細胞難 以控制這兩者之間的比例。針對這個問題，Chen等將shRNA和Ag 〇2構建在同一個表達載 體上，并將表達載體導入到非洲蟾蜍神經細胞中進行RNAi實驗，結果表明該表達載體比普 通的shRNA在神經細胞中有更高的干擾水平（Chen, C. M. Front Neurosci, 2009. 3:P. 63.)。 但是，上述實驗中shRNA表達載體在細胞中的轉染效率不高，影響了 shRNA在細胞的高水平 表達；同時，上述技術都是進行載體的瞬時表達（即短時間表達)，難以維持shRNA的長時間 作用；另外，已有技術采用的基因表達功能元件的種類、結構和組合方式等條件非最佳，這 也阻礙了 shRNA干擾作用的有效發揮。因此，現有表達shRNA的技術還有待于改進和發展。
【發明內容】
[0006] 為了解決上述問題，本發明提供了一種shRNA-Ago2共表達慢病毒RNAi載體、重組 質粒及其構建方法，該載體引入細胞后可持續、高效的同時表達目的基因的shRNA和增強 因子Ago2。
[0007] 為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0008] 一種shRNA-Ago2共表達慢病毒RNAi載體，包含shRNA表達框和Ago2蛋白表達框， 所述shRNA表達框包含啟動子U6、H1或7SK，以及ccdB致死基因；所述的Ag 〇2蛋白表達框 包含CMV強啟動子、Ag〇2蛋白表達基因、內部核糖體進入位點DNA序列和ZsGreenl綠色熒 光蛋白表達基因。
[0009] 優選地，所述的ccdB致死基因的兩端設有限制性酶切位點BamHI和MluI。
[0010] 一種shRNA-Ago2共表達慢病毒RNAi載體的構建方法，包括以下步驟：
[0011] (1)制備用于構建載體的骨架pLVX-IRES-ZsGreenl-Puro :
[0012] 以 pLVX-IRES-ZsGreenl 載體為模板，擴增得到 IRES-ZsGreenl 片段， 用Clal-Xbal雙酶切PCR產物，然后通過相應的位點克隆到pLVX-Puro載體，得到 pLVX-IRES-ZsGreenl-Puro 載體骨架。
[0013] (2)插入增強因子Ago2基因表達框CMV_Ago2 :
[0014] 用 MluI 和 EcoRI 雙酶切 pIRESne〇-FLAG/HA-Ag〇2 載體，得到 CMV-Ago2 片段，將 CMV-Ag〇2片段與步驟（1)回收的pLVX-IRES-ZsGreenl-Puro載體骨架連接，轉入大腸桿菌 感受態細胞，涂LB平板，培養過夜，進行菌落PCR及酶切鑒定，得到的載體pLVX-CMV-Ag 〇2-IRES-ZsGreenl-Puro ；
[0015] (3)插入shRNA表達啟動子：
[0016] 用 BclI 和 MluI 雙酶切步驟（2)得到的載體 pLVX-CMV-Ago2-IRES-ZsGreenl-Puro ，去磷酸后電泳回收；用BclI和MluI雙酶切擴增hU6、Hl或7SK啟動子的PCR產物后，連接 到pLVX-CMV-Ago2-IRES-ZsGreenl-Puro載體的相應位點上，轉入大腸桿菌感受態細胞中， 涂LB平板，培養過夜，鑒定后得到的載體為： PLVX-hU6/Hl/7SK-CMV-Ago2-IRES-ZsGreenl- Puro ο
[0017] (4)插入ccdB序列得到shRNA-Ago2共表達慢病毒RNAi載體：
[0018] 以pLenti6載體為模板，擴增出含有大腸桿菌ccdB致死基因的片段，將擴增的到 的ccdB用BamHI和Mlu I雙酶切后，與經過BamHI和Mlu I雙酶切的pLVX-hU6/Hl/7SK-C MV-Ago2-IRES-ZsGreenl_Puro載體連接，轉入大腸桿菌感受態細胞中，涂LB/amp+Chl雙抗 平板，培養過夜，進行菌落PCR及酶切鑒定，得到shRNA-Ag 〇2共表達慢病毒RNAi載體，載體 骨架是 pLVX-hU6/Hl/7SK-ccdB-CMV-Ago2-IRES-ZsGreenl-Puro。
[0019] 在上述方案中，能夠同時在同一載體上使用hU6、Hl或7SK啟動子驅動shRNA的 表達，CMV啟動子驅動Ag 〇2的表達和綠色熒光蛋白的表達。ccdB兩端設有限制性酶切位 點BamHI和Mlul，用于構建和篩選含目的基因 shRNA陽性克隆的shRNA-Ag〇2共表達慢病 毒RNAi載體。增強因子Ag〇2的表達既保證了導入細胞的shRNA最大量地裝載于沉默復合 體RISC、便于shRNA對其目的基因進行剪切、增強目的基因的沉默；同時也用于維持細胞內 miRNA介導的RNAi路徑的正常進行，降低外源導入shRNA對細胞功能的影響。
[0020] 本發明還提供了一種shRNA-Ago2共表達慢病毒重組質粒，所述shRNA-Ago2共表 達慢病毒重組質粒包含上述的shRNA-Ago2共表達慢病毒RNAi載體。
[0021] 優選地，所述shRNA-Ag〇2共表達慢病毒重組質粒還包含目的基因 shRNA，所述 shRNA的莖部長度為19~22bp，所述shRNA的loop長度是4~9bp。
[0022] 優選地，所述shRNA的莖部長度為20bp。
[0023] 優選地，所述shRNA的loop長度是6~9bp。
[0024] 優選地，所述shRNA的sense/antisense結構是從5'端開始的 sense-loop-antisense 結構。
[0025] 本發明還提供了一種shRNA-Ago2共表達慢病毒重組質粒的構建方法，包括以下 步驟：
[0026] 1)針對目的基因設計shRNA編碼序列，化學合成兩條引物，將兩條引物退火形成 帶限制性內切酶BamHI和MluI黏性末端的shRNA ;
[0027] 2)通過限制性內切酶BamHI和MluI消化上述shRNA-Ago2共表達慢病毒RNAi載 體骨架，酶切回收后，將載體骨架與退火的shRNA進行連接，轉化大腸桿菌感受態細胞并涂 板培養過