小麥TaSPL3基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及作物分子生物學和分子育種領域，更具體地，涉及小麥TaSPL3基因及 其在染色體中的定位、以及該基因 miR156靶位點突變后的應用。
【背景技術】
[0002] 小麥作為一種重要的糧食作物，全世界有35%-40%的以小麥為主要糧食。同時 作為三大谷物之一，產量幾乎全做食用，是世界上總產量僅次于玉米的糧食作物。隨著水 稻、玉米等在內的多種植物全基因組測序的完成，人類開始進入功能基因的時代。利用物種 已知功能的目標基因進行序列比對和分析，利用高保守序列對研宄物種進行引物設計和同 源序列克隆，是發現新基因的常用方法之一。
[0003] SPL (squamosa promoter binding protein-like)是一類植物特有的轉錄因子， 在調控植物生長和生殖階段轉變、花和果實發育、光信號轉導及植株形態建成等多種發育 過程中發揮重要作用。SPL含有一個由80個氨基酸殘基組成的高度保守的SBP結構域，以 此同下游靶基因啟動子區域結合，調控靶基因的表達。大多數SPL均具有miR156/157識 別位點，miR156/157可以通過靶mRNA剪切或翻譯抑制來調控SPL的表達。
[0004] 目前，在水稻中，對SPL基因有了比較詳盡的認識。小麥作為人類重要的糧食作 物，但是關于SPL基因家族在小麥中結構和功能分析還是知之甚少。對該基因在小麥的生 物功能和分子基礎尚不清楚。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供小麥TaSPL3基因及其應用。
[0006] 利用水稻SPL基因保守的SBP結構域和小麥二倍體AA、DD基因草圖測序結果， 先在二倍體中克隆SPL基因，利用二倍體與六倍體的同源性，然后以普通小麥中國春葉片 cDNA為模板利用PCR方法擴增得到在A、B、D同源染色體上的基因序列，分別如SEQ ID NO. 1-3所示，該基因命名為TaSPL3。該基因定位于第六染色體同源群上。
[0007] 本發明提供了小麥TaSPL3基因在小麥育種中的應用。
[0008] 本發明提供了小麥TaSPL3基因在促進植物生長中的應用。
[0009] 本發明提供了小麥TaSPL3基因在制備轉基因植物中的應用。
[0010] 具體地，本發明所述的小麥TaSPL3基因位于小麥第六同源群上，其在小麥6A同源 染色體的序列如SEQ ID NO. 1所示，其在小麥6B同源染色體的序列如SEQ ID NO. 2所示， 其在小麥6D同源染色體的序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0011] 本發明提供了用于克隆小麥TaSPL3基因的引物組合，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4-5 所示。
[0012] 本發明提供了上述引物組合在小麥遺傳育種中的應用。
[0013] 含有上述引物組合的試劑盒屬于本發明的保護范圍。
[0014] 相應地，本發明提供了小麥TaSPL3基因的克隆方法，利用SEQ ID NO. 4-5所示的 特異性引物組合，以小麥葉cDNA為模板，PCR擴增得到小麥TaSPL3基因。
[0015] 進一步，本發明還提供了檢測小麥TaSPL3基因的SNP分子標記，檢測小麥TaSPL3A 基因的SNP分子標記通過以下引物擴增得到：
[0016] SPL3A-F-primer CGGCAGCGGCAGCGGCAA
[0017] SPL3A-R-primer CCTATCAGTGTTTTTGACGG ；
[0018] 檢測小麥TaSPL3B基因的SNP分子標記通過以下引物擴增得到：
[0019] SPL3B-F-primer ATTCTTCTGGCGGCAGTG
[0020] SPL3B-R-primer CAACTTTACCCAACTCAGGG ；
[0021] 檢測小麥TaSPL3D基因的SNP分子標記通過以下引物擴增得到：
[0022] SPL3D-F-primer TCCATTCTTCTGGCGGTAG
[0023] SPL3D-R-primer AACTTTACCCAGCTCGGTGo
[0024] 本發明提供了上述SNP分子標記在檢測小麥TaSPL3基因中的應用。
[0025] 進一步地，利用上述檢測小麥TaSPL3基因的SNP分子標記的引物對擴增待測樣 品，若得到的目的條帶為I. 3kb，則意味著待測樣品中存在TaSPL3基因。
[0026] 本發明還提供了 miR156靶位點突變的小麥TaSPL3基因，小麥TaSPL3基因突變后 的miR156靶位點的核苷酸序列為CAU GCA CUG UCG CUC UUG UCU，如SEQ ID NO. 12所示。
[0027] 進一步地，本發明提供了一種使小麥TaSPL3A基因的miR156靶位點突變的方法， 包括以下步驟：
[0028] (1)以SPL3A-0E-F和m3A-R為引物，SPL3A的PCR產物為模板，進行PCR擴增，回 收PCR產物；
[0029] (2)以m3A-F和SPL3A-0E-R為引物，SPL3A的PCR產物為模板，進行PCR擴增，回 收PCR產物；
[0030] (3)將前述兩次PCR的產物回收后等量混勻，以此為模板，以SPL3A-0E-F和 SPL3A-0E-R為引物，再進行PCR，擴增產物即為miRl56靶位點突變的小麥TaSPL3基因；所 述 m3A-F、m3A-R 和 SPL3A-0E-F、SPL3A-0E-R 的核苷酸序列分別如 SEQ ID NO. 13-16 所示；
[0031] 所述SPL3A的PCR產物是以SEQ ID NO. 4-5的序列為引物PCR擴增小麥基因組 cDNA得到的。
[0032] miR156靶位點突變的小麥TaSPL3基因的制備方法，包括以下步驟：
[0033] (1)以SPL3A-0E-F和m3A-R為引物，SPL3A的PCR產物為模板，進行PCR擴增，回 收PCR產物；
[0034] (2)以m3A-F和SPL3A-0E-R為引物，SPL3A的PCR產物為模板，進行PCR擴增，回 收PCR產物；
[0035] (3)將前述兩次PCR的產物回收后等量混勻，以此為模板，以SPL3A-0E-F和 SPL3A-0E-R為引物，再進行PCR，擴增產物即為miRl56靶位點突變的小麥TaSPL3基因；所 述 m3A-F、m3A-R 和 SPL3A-0E-F、SPL3A-0E-R 的核苷酸序列分別如 SEQ ID NO. 13-16 所示；
[0036] 所述SPL3A的PCR產物是以SEQ ID NO. 4-5的序列為引物PCR擴增小麥基因組 cDNA得到的。
[0037] 本發明提供了 miRl56靶位點突變的小麥TaSPL3A基因或TaSPL3B基因或TaSPL3D 基因在制備轉基因植物中的應用，所述的miR156靶位點突變后的序列如SEQ ID NO. 12所 不ο
[0038] 本發明提供了 miRl56靶位點突變的小麥TaSPL3A基因或TaSPL3B基因或