重組人胰島素的表達(dá)方法及專(zhuān)用表達(dá)載體、工程菌和應(yīng)用
【專(zhuān)利說(shuō)明】重組人胰島素的表達(dá)方法及專(zhuān)用表達(dá)載體、工程菌和應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的是指一種重組人胰島素的表達(dá)方法及專(zhuān)用表達(dá) 載體、工程菌和應(yīng)用。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 糖尿病是一種由先天或后天因素引起的胰島素缺乏或缺少所引起的慢性疾病。這 種胰島素的缺乏使得血糖濃度升高從而導(dǎo)致機(jī)體，特別是血管和神經(jīng)的損傷。多飲、多尿、 多食、消瘦是糖尿病的典型癥狀，嚴(yán)重的還會(huì)出現(xiàn)包括酮中毒和多種臟器的慢性病變等情 況。
[0003] 糖尿病主要分為兩種類(lèi)型：1型和II型。I型糖尿?。═ype I diabetes mellitus，TlDM)是一種自身免疫性疾病，患者的胰腺被免疫系統(tǒng)破壞，造成胰島素的絕對(duì) 缺乏，多發(fā)于青少年，其治療方法只能通過(guò)一日三次注射胰島素來(lái)保持血糖穩(wěn)定。II型糖尿 ?。═ype II diabetes mellitus，T2DM)，多發(fā)病于中老年，是一種胰島素相對(duì)缺乏或胰島 素抵抗的疾病，通常與肥胖、飲食等多種因素有關(guān)，與免疫系統(tǒng)無(wú)關(guān)，主要通過(guò)健康的飲食 和適當(dāng)?shù)腻憻挘媒笛撬幬镆约白⑸湟葝u素來(lái)恢復(fù)和治療。
[0004] 針對(duì)I型糖尿病，有研宄表明通過(guò)給TlDM的模型非肥胖糖尿?。∟on-obese diabetic，NOD)小鼠口服胰島素能夠減輕或延緩其發(fā)病過(guò)程，其機(jī)制是抗原通過(guò)黏膜 Peyer' s區(qū)吸收，從而激活免疫系統(tǒng)，之后與耐受性相關(guān)的效應(yīng)T細(xì)胞被激活，引發(fā)口服耐 受性，從而保護(hù)胰島素不被損傷。但是如果直接口服抗原，因?yàn)榭乖^大多數(shù)都是蛋白質(zhì)， 蛋白質(zhì)在口服過(guò)程中經(jīng)過(guò)胃腸環(huán)境的影響，會(huì)發(fā)生明顯的降解，因此嚴(yán)重影響抗原的有效 作用效率。因此需要一種能夠達(dá)到食品級(jí)要求的運(yùn)輸載體來(lái)降低或減輕抗原在經(jīng)過(guò)腸胃環(huán) 境時(shí)所受的損傷。
[0005] 乳酸菌在自然界中分布廣泛，且自古就被人類(lèi)用于食品加工及制作，因此由于其 在食品行業(yè)的廣泛而長(zhǎng)期的應(yīng)用，通常被認(rèn)為是安全的食品級(jí)的生物。同時(shí)乳酸菌作為益 生菌的主要組成，具有抑制有害菌的增殖，降低膽固醇，降血壓，維持生態(tài)系統(tǒng)平衡，抑癌和 增強(qiáng)免疫力等重要的生物學(xué)功能。而且已有研宄表明，將相應(yīng)抗原經(jīng)乳酸菌工程菌進(jìn)行表 面展示，進(jìn)行動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)可以使該動(dòng)物宿主獲得相應(yīng)的免疫反應(yīng)，如Ke-Qin Xin等人的研 宄將HIV病毒Env基因的V2-V4環(huán)（V2-V41〇〇p)通過(guò)乳酸菌表面蛋白進(jìn)行表面展示，并 經(jīng)過(guò)小鼠口服實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)能夠刺激小鼠產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)（Ke-Qin Xin. Immunogenicity and protective efficacy of orally administered recombinant Lactococcus lactis expressing surface-bound HIV Env. BLOOD,IJULY 2003V0LUME 102, NUMBER I)〇
[0006] 為了完全符合真正意義上的食品級(jí)乳酸菌工程菌，除了宿主菌是食品級(jí)之外，其 所用到的載體也要相應(yīng)達(dá)到食品級(jí)要求，即不能夠具有絕大部分表達(dá)載體所使用的篩選標(biāo) 記一抗性基因，因?yàn)橛捎诳剐曰虻拇嬖?，有可能?duì)動(dòng)物或人體腸道的正常菌群產(chǎn)生不利 影響，打亂其正常的腸道微生態(tài)系統(tǒng)的平衡。因此有必要利用不含抗性基因的表達(dá)載體和 乳酸菌來(lái)構(gòu)建工程菌，從而符合完全食品級(jí)要求，達(dá)到能夠口服利用的要求。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0007] 有鑒于此，為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種重組人胰島素的表達(dá)方法及 專(zhuān)用表達(dá)載體、工程菌和應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明第一個(gè)目的是提供一種編碼重組人胰島素的基因，其特征在于：所述基因 為SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0009] 作為優(yōu)選方案，所述專(zhuān)用表達(dá)載體是含有誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子、重組人胰島素編碼 序列、乳酸菌細(xì)胞表面蛋白編碼序列的乳酸菌誘導(dǎo)型表面展示表達(dá)載體；其中重組人胰島 素編碼序列與乳酸菌細(xì)胞表面蛋白編碼序列形成融合基因，重組人胰島素編碼序列位于乳 酸菌細(xì)胞表面蛋白編碼序列的5'端，誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子位于所述融合基因的上游。
[0010] 進(jìn)一步地，所述細(xì)胞表面蛋白為細(xì)菌表面蛋白PgsA、SPA、PrtB、PrtP、AcmA、HtrA 或 SspA0
[0011] 更進(jìn)一步地，用于構(gòu)建重組人胰島素誘導(dǎo)型表達(dá)載體的出發(fā)載體為pMG36e、 PVE5523、pIL253、pNZ8008、pNZ8048、pNZ8148、pNZ8149、pNZ8150 或 pNZ9530 ;以 pNZ8149 為出發(fā)載體，構(gòu)建的重組人胰島素乳酸菌不含抗性基因篩選標(biāo)記的誘導(dǎo)型表達(dá)載體為 PMRF5018。
[0012] 本發(fā)明第二個(gè)目的是提供一種表達(dá)重組人胰島素基因的工程菌，其特征在于：是 將上述的專(zhuān)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入乳酸菌中得到的重組菌。
[0013] 進(jìn)一步地，所述乳酸菌為乳酸乳球菌L. lactisNZ3900或L. Iactis NZ3910。
[0014] 更進(jìn)一步地，所述重組乳酸菌為L(zhǎng) lactisNZ3900/pMRF5018。
[0015] 本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種重組人胰島素基因的表達(dá)方法，其特征在于：是發(fā) 酵上述的工程菌，得到展示于乳酸菌表面的重組人胰島素。
[0016] 進(jìn)一步地，所述發(fā)酵攜帶有誘導(dǎo)型胞內(nèi)表達(dá)載體的重組乳酸菌胞面展示重組人胰 島素時(shí)需加入乳鏈菌肽Nis in，所加入Nis in的終濃度為30ng/ml，誘導(dǎo)溫度為30°C，誘導(dǎo) 時(shí)間為10小時(shí)。
[0017] 本發(fā)明第四個(gè)目的是提供了種上述的工程菌在制備預(yù)防或治療I型糖尿病口服 疫苗中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明提供的重組人胰島素編碼基因序列，其為SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列， 是經(jīng)過(guò)乳酸菌密碼子優(yōu)化且在天然人胰島素的A、B鏈基因序列之間引入一段額外基因序 列，該基因序列經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯成的連接肽能夠形成β折疊，從而使本發(fā)明提供的重組人 胰島素具有與天然胰島素非常相似的結(jié)構(gòu)。
[0019] 本發(fā)明所提供的用于表達(dá)重組人胰島素的表達(dá)載體，是含有誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子， 重組人胰島素編碼序列和乳酸菌細(xì)胞表面蛋白編碼序列的乳酸菌誘導(dǎo)表面展示表達(dá)載體。 其中重組人胰島素編碼序列與乳酸菌細(xì)胞表面蛋白編碼序列形成融合基因，重組人胰島素 編碼序列位于乳酸菌細(xì)胞表面蛋白編碼序列的5'端，誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子位于所述融合基因 的上游。
[0020] 所述乳酸菌誘導(dǎo)型胞內(nèi)表達(dá)載體中細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白的可選擇范圍非常廣 泛，比如細(xì)菌表面蛋白 PgsA (GenBank 號(hào)：KJ175232. I)、SPA (GenBank 號(hào)：KJ794101. 1)、 PrtB (GenBank 號(hào)：L48487. 2)、PrtP (GenBank 號(hào)：FM883700.1 )、AcmA(GenBank 號(hào)： U17696. I)、HtrA (GenBank 號(hào)：AJ005672. I)、SspA (GenBank 號(hào)：JNl 12240. 1)等。
[0021] 用于構(gòu)建重組人胰島素表達(dá)的乳酸菌誘導(dǎo)型表達(dá)載體的出發(fā)載體具有廣泛的選 擇范圍，比如常見(jiàn)的有口犯8008邛犯8048邛犯8148邛犯8149邛犯8150或口犯9530等。
[0022] 以pNZ8149為出發(fā)載體構(gòu)建的含有所述的重組人胰島素編碼序列及乳酸乳球菌 自溶素 AcmA編碼序列的乳酸菌誘導(dǎo)型胞內(nèi)表達(dá)載體為pMRF5018。
[0023] 上述表達(dá)載體可按照基因工程領(lǐng)域的常規(guī)方法進(jìn)行構(gòu)建。
[0024] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明所構(gòu)建的用于表達(dá)重組人胰島素的表達(dá)載體，是含有 誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子，重組人胰島素編碼序列和乳酸菌細(xì)胞表面蛋白編碼序列的乳酸菌誘導(dǎo) 胞內(nèi)表達(dá)載體。將所構(gòu)建成功的重組人胰島素專(zhuān)用表達(dá)載體導(dǎo)入相應(yīng)乳酸菌，即可得到重 組人胰島素表達(dá)的專(zhuān)用乳酸菌工程菌。培養(yǎng)和發(fā)酵該乳酸菌工程菌即可實(shí)現(xiàn)重組人胰島素 在乳酸菌表面展示表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的重組人胰島素專(zhuān)用表達(dá)工程菌能夠正確的在 其表面對(duì)重組人胰島素進(jìn)行展示表達(dá)，定位于乳酸菌工程菌表面的重組人胰島素具有與天 然胰島素十分相似的空間結(jié)構(gòu)，其可以與胰島素多克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合。
[0025] 通過(guò)對(duì)TlDM的模型非肥胖糖尿?。∟on-obese diabetic，NOD)小鼠口服實(shí)驗(yàn)證 明，本發(fā)明構(gòu)建的乳酸菌工程菌能夠在腸道內(nèi)存活48小時(shí)以上，同時(shí)可以刺激NOD小鼠免 疫系統(tǒng)產(chǎn)生重組人胰島素特異性抗體，使與免疫耐受相關(guān)的細(xì)胞因子IL-4水平顯著上升， 誘導(dǎo)免疫耐受產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的能夠表面展示重組人胰島素的乳酸菌工程菌 能夠有效的治療或預(yù)防I型糖尿病。
[0026] 本發(fā)明利用的表達(dá)載體，宿主工程菌，誘導(dǎo)劑Nisin等完全符合食品級(jí)要求，其中 最主要的一點(diǎn)是表達(dá)載體是非抗性基因攜帶型質(zhì)粒，口服之后不存在因抗性基因存在而產(chǎn) 生的對(duì)人體腸道菌群微生態(tài)系統(tǒng)的破壞等潛在風(fēng)險(xiǎn)。只需將誘導(dǎo)后的乳酸菌工程菌制成菌 劑即可作為I型糖尿病的口服疫苗，不需要純化等繁瑣的后加工過(guò)程，具有廣泛的應(yīng)用前 景。 【【附圖說(shuō)明】】
[0027] 圖1為本發(fā)明人胰島素基因⑴與重組人胰島素基因（2)序列比對(duì)分析。
[0028] 圖2為本發(fā)明重組人胰島素誘導(dǎo)型表面展示表達(dá)載體的pMRF5018構(gòu)建過(guò)程的示 意圖。
[0029] 圖3為本發(fā)明工程菌L. lactisNZ3900/pMRF5018及相應(yīng)陰性對(duì)照誘導(dǎo)表達(dá)后提取 蛋白進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果圖。
[0030] 圖4為本發(fā)明工程菌L. lactisNZ3900/pMRF5018及相應(yīng)陰性對(duì)照誘導(dǎo)表達(dá)后對(duì)菌 體進(jìn)行熒光顯微鏡下拍照結(jié)果圖。
[0031] 圖5為本發(fā)明取工程菌L. lactisNZ3900/pMRF5018誘導(dǎo)前后的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞 儀分析結(jié)果圖。
[0032] 圖6為本發(fā)明不同處理組NOD小鼠血清中重組人胰島素特異性抗體檢測(cè)分析圖。
[0033] 圖7為本發(fā)明不同處理組NOD小鼠血清中IL-4水平檢測(cè)結(jié)果。 【【具體實(shí)施方式】】
[0034] 為了更好地理解本發(fā)明，以下將結(jié)合附圖和具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。 下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為