抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于生產(chǎn)抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的生物反應器的制備方法以及利用該生物反應器制備抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的方法，通過建立能夠特異性表達針對丙型肝炎病毒基因組的干擾核糖核酸(SiRNA)的乳腺生物反應器，為治療丙肝的SiRNA藥物的研制和生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
【背景技術(shù)】
[0002]丙型肝炎病毒Ofepatitis Cvirus)簡稱丙肝病毒(HCV)，于1978年被發(fā)現(xiàn)，其由外殼和其中的單鏈RNA組成。1989年，HCV基因組序列被首次獲得。HCV主要經(jīng)血源傳播，此外還可以通過其他方式傳播，如母嬰垂直傳播和性傳播等。HCV感染可引發(fā)丙型肝炎，但發(fā)病機理仍不十分清楚。臨床觀察資料表明，人感染HCV后所產(chǎn)生的保護性免疫力很差，臨床上50 %的丙型肝炎病人可發(fā)展為慢性肝炎，甚至部分病人會發(fā)展為肝硬化及肝細胞癌。
[0003]目前尚無針對丙型肝炎的疫苗，唯一的預防措施是防止血液接觸。被發(fā)現(xiàn)感染HCV后，通常采取的是聚乙二醇干擾素a-2a或a-2b (peginterferon)聯(lián)合病毒唑(ribavirin)治療。這也是迄今為止唯一有效的方案。但是，聚乙二醇干擾素與病毒唑單獨和/或聯(lián)合使用治療丙型肝炎帶來的毒副作用不容忽視，其在適宜人群和與其他藥物聯(lián)用方面也面臨諸多限制。
[0004]近年來出現(xiàn)了多種輔助抗病毒藥物治療的新型技術(shù)，包括核酶技術(shù)、細胞內(nèi)干擾性多肽或蛋白質(zhì)療法，以及DNA免疫療法等。其中，核酶(ribozyme)技術(shù)是指通過人工合成具有催化活性的小分子核酶，即有催化活性的單鏈RNA分子，例如發(fā)夾狀核酶，與靶RNA中的互補序列特異性結(jié)合進而進行切割。在上述新型技術(shù)中，小干擾核糖核酸(smallinterfering RNA,縮寫為siRNA)藥物又是一大熱點。RNA干擾(RNA interference,縮寫為RNAi)是指一種分子生物學上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達。當細胞中導人與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時，該mRNA發(fā)生降解，從而導致基因表達沉默。此現(xiàn)象可對外來基因材料，如轉(zhuǎn)位子、病毒等對基因組的破壞起到防御作用。通過RNAi機制，siRNA可特異性地、有效地沉默靶基因。已有研究證明，siRNA作用于HCV、HBV和HIV，都能表現(xiàn)出抗病毒作用(Nat.B1technol.21(6):639-644(2003) ；S.B.Kapadia, et al.1nterference of hepatitis C virus RNArepli cat1n by short interfering RNAs.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.100 (4):2014-2018(2003) ；J.A.Wilson, et al.RNA interference blocks gene express1n andRNA synthesis from hepatitis C replicons propagated in human liver cells.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.100(5):2783-2788(2003) ；A.P.McCaffrey, et al.1nhibit1n ofhepatitis B virus in mice by RNA interference.G.A.Coburn and B.R.Cullen.Potentand specific inhibit1n of human immunodeficiency virus typelreplicat1n by RNAinterference.J.Virol.76(18):9225-9231 (2002))。
[0005]雖然使用siRNA治療丙肝的療效前景樂觀，但仍需克服諸多方面的技術(shù)難題，包括siRNA的靶向性有效釋放、siRNA的制備等。目前，制備siRNA的方法主要有化學合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、酶切長鏈dsRNA法、siRNA表達載體法和PCR表達框法。這些方法普遍存在產(chǎn)出率較低、生產(chǎn)成本較高的缺點。
[0006]動物乳腺生物反應器的研究則始于1987年，Gordon等將組織型纖溶酶原激活劑(tPA)與小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的啟動子構(gòu)成重組基因，成功地培育出了 37只在乳汁中能表達tPA的轉(zhuǎn)基因小鼠。同年，世界上第一只能從乳汁中分泌α 1-抗胰蛋白酶(AAT)的轉(zhuǎn)基因綿羊在英國羅斯林研究所誕生。從此，開始了乳腺生物反應器的實用性研究。Simons等(Simons等，1987年)將帶MT啟動子的β -乳球蛋白_凝血因子IX(BLG-FIX)、BLG-AAT等重組DNA片段注射到綿羊受精卵中，獲得了在乳汁中有外源基因表達的轉(zhuǎn)基因后代。Wilmut等將羊乳球蛋白基因片段與F-1X和AAT-cDNA融合質(zhì)粒注入小鼠及綿羊受精卵中，獲得乳汁中含F(xiàn)-1X和AAT的轉(zhuǎn)基因小鼠及綿羊。Wright等將綿羊BLG基因調(diào)控區(qū)與人AAT基因相連，獲得了 4只轉(zhuǎn)基因綿羊。Velander等利用WAP基因啟動子與人蛋白質(zhì)C(hPC) cDNA重組基因獲得轉(zhuǎn)基因豬，重組hPC的表達量(lg/L)此人血中hPC濃度還高200倍。Ebert等用β-CA基因的啟動子引導tPA在山羊乳汁中得到表達(l_3g/L)。Wilmut等(Wilmut等，1997年)首創(chuàng)體細胞克隆rl并表達人F-1X的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊。2000年，英國PPL公司將人類AAT基因定點整合到胎兒成纖維細胞的前膠原基因座上，用轉(zhuǎn)基因細胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因打靶綿羊(McCreath等，2000年)；2001年，他們又利用基因打靶技術(shù)生產(chǎn)出了AAT、3-GT和朊病毒雙剔除的克隆綿羊。上述研究可以看出，從模式動物-小鼠的轉(zhuǎn)基因研究開始，研究人員逐步建立起了大動物乳腺生物反應器制備的技術(shù)平臺。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]目前，治療HCV感染采用的干擾素和核苷類似物普遍存在副作用較大，療效不理想，且?guī)缀醪豢杀苊獬霈F(xiàn)病毒耐藥變異性等缺陷，而自上世紀90年代興起的RNAi技術(shù)以其對病毒抑制作用的靶向性、特異性和高效性，為HCV感染的治療帶來新的希望。但是，現(xiàn)有RNAi技術(shù)所必需的siRNA的制備技術(shù)尚存在產(chǎn)出率低和生產(chǎn)成本高等缺陷，而動物乳腺生物發(fā)生器技術(shù)以其天然、高效和低成本的特征，可以克服上述siRNA制備技術(shù)的缺陷。本發(fā)明人將目光鎖定在牛乳腺生物發(fā)生器在生產(chǎn)抗HCV siRNA方面的應用前景，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)形成可在牛乳中表達抗HCV siRNA的乳牛，使其穩(wěn)定而高效地生產(chǎn)抗HCV的siRNA，為HCV的基因藥物研發(fā)提供穩(wěn)定的物質(zhì)基礎(chǔ)。具體來說，將外源目的基因?qū)肴榕；蚪M并定位表達于牛乳腺中，利用動物乳腺天然、高效合成并分泌有機物的能力，從牛乳中生產(chǎn)出具備抗HCV能力的si RNAs。
[0008]本發(fā)明所述的生物反應器是指采用轉(zhuǎn)基因方法將外源性目的基因轉(zhuǎn)入生物，例如乳牛，形成的能夠分泌外源性目的基因產(chǎn)物的生物體，例如乳牛。
[0009]本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的生物反應器的制備方法，該制備方法包括以下步驟:
[0010](I)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的載體；具體來說，所述抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸為能夠?qū)е卤透窝撞《净蚪M發(fā)生特異性降解的小干擾核糖核酸；
[0011](2)將步驟(I)構(gòu)建的載體導入受體細胞，所述受體細胞為乳牛受精卵細胞、胚胎干細胞或早期胚胎；
[0012](3)利用步驟(2)制得的受體細胞通過假孕乳牛發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛。
[0013]在上述生物反應器中，載體還可以包含一種或多種選自半乳糖基因啟動子、酪蛋白啟動子、乳球蛋白啟動子、S1-酪蛋白基因啟動子、乳清酸蛋白啟動子和乳清蛋白基因啟動子的基因序列。
[0014]在本發(fā)明的一個實施方案中，上述生物反應器的制備方法采用顯微注射法，具體包括以下步驟:
[0015](I)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的載體；
[0016](2)將步驟⑴構(gòu)建的載體導入乳牛受精卵細胞；
[0017](3)將步驟(2)制得的乳牛受精卵細胞置于假孕乳牛輸卵管中發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛。
[0018]在本發(fā)明的另一個實施方案中，上述生物反應器的制備方法采用逆轉(zhuǎn)錄病毒法，具體包括以下步驟:
[0019](I)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；優(yōu)選地，編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列連接在逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的LTR下部；更優(yōu)選地，將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝成高滴度病毒顆粒。
[0020](2)將步驟(I)構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導人乳牛受精卵細胞；這樣包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因被整合到乳牛受精卵細胞的基因組。
[0021](3)將步驟(2)制得的乳牛受精卵細胞置于假孕乳牛輸卵管中發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛。
[0022]在本發(fā)明的又一個實施方案中，上述生物反應器的制備方法采用胚胎干細胞(embryonic stem cell, ES細胞)法,具體包括以下步驟:
[0023](I)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的載體；
[0024](2)將步驟⑴構(gòu)建的載體導人乳牛胚胎干細胞；
[0025](3)將步驟⑵制得的乳牛胚胎干細胞與乳牛胚囊細胞混合(例如通過囊胚腔注射混合)，置于假孕乳牛子宮中發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛。優(yōu)選地，可以再利用生殖系嵌合子代設(shè)計進行交配育種獲得純系。
[0026]對上述技術(shù)方案獲得的轉(zhuǎn)基因乳牛的遺傳性能進行觀察和研究，結(jié)果顯示這些轉(zhuǎn)基因乳牛均可以作為生物反應器高效、穩(wěn)定地生產(chǎn)抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸。
[0027]本發(fā)明還提供了一種抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的制備方法，該制備方法包括以下步驟:
[0028](I)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的載體；具體來說，所述抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸為能夠?qū)е卤透窝撞《净蚪M發(fā)生特異性降解的小干擾核糖核酸；
[0029](2)將步驟(I)構(gòu)建的載體導人乳牛受體細胞，所述受體細胞為受精卵細胞、胚胎干細胞或早期胚胎；
[0030](3)利用步驟(2)制得的受體細胞通過假孕乳牛發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛；
[0031](4)從步驟(3)制得的轉(zhuǎn)基因乳牛分泌的牛乳中獲得抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸。
[0032]在上述制備方法中，載體還可以包含一種或多種選自半乳糖基因啟動子、β -酪蛋白啟動子、乳球蛋白啟動子、S1-酪蛋白基因啟動子、乳清酸蛋白啟動子和乳清蛋白基因啟動子的基因序列。
[0033]在本發(fā)明的一個實施方案中，上述制備方法優(yōu)選采用顯微注射法，具體包括以下步驟:
[0034](I)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的載體；
[0035](2)將步驟⑴構(gòu)建的載體導入乳牛受精卵細胞；
[0036](3)將步驟⑵制得的乳牛受精